Name: two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins
Uploaded: 2012-09-28T12:00:00
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R01NS064593 및 R21ES016636 (KV)에 의해 부분적으로 지원. 현미경은 VCU에서 수행 된 - 신경 생물학 및 해부학 현미경 시설의 부, NIH-NINDS 센터 핵심 보조금 5P30NS047463의 자금으로 일부를 지원합니다. 회전 디스크 공 촛점 현미경은 NIH-NCRR 상 (1S10RR027957)를 구입했습니다.

A. 셀 준비 <ol><li> 일반 인간의 기본 섬유 아세포 (GM02270)는 Coriell 셀 저장소, 캠든 (Camden), 뉴저지에서 얻은 및 hTERT 6 불후의되었습니다. 셀은 CellStar에서 재배하고 확장 된 20% 태아 소 혈청 (GIBCO), non-essential/essential 아미노산, 비타민, 나트륨 pyruvate, 그리고 페니실린 / 스트렙토 마이신 (HyClone을 보충 가상으로 구성된 미디어 6 cm 요리 (4 ML) ). </li><li> 인간 배아 신장 293 (HEK293) 전지는 미국 유?...

<ol>
	<li>Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+methylation+state-specific+recognition+of+histone+H4-K20+by+53BP1+and+Crb2+in+DNA+repair.">Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair.</a> Cell. 127, 1361-1373 (2006).</li><li>Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+promotes+non-homologous+end+joining+of+telomeres+by+increasing+chromatin+mobility.">53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility.</a> Nature. 456, 524-528 (2008).</li><li>Feuerhahn, S., Egly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+study+DNA+repair:+what's+in+the+box.">Tools to study DNA repair: what's in the box.</a> Trends Genet. 24, 467-474 (2008).</li><li>Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+signaling+in+response+to+double-strand+breaks+during+mitosis.">DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis.</a> J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).</li><li>Giunta, S., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Give+me+a+break,+but+not+in+mitosis:+the+mitotic+DNA+damage+response+marks+DNA+double-strand+breaks+with+early+signaling+events.">Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events.</a> Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).</li><li>Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-survival+AKT+and+ERK+signaling+from+EGFR+and+mutant+EGFRvIII+enhances+DNA+double-strand+break+repair+in+human+glioma+cells.">Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells.</a> Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).</li><li>Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylated+lysine+79+of+histone+H3+targets+53BP1+to+DNA+double-strand+breaks.">Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks.</a> Nature. 432, 406-411 (2004).</li><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease.">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461, 1071-1078 (2009).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).</li><li>Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+fluorescence+imaging+of+live+cells+by+effective+cytosolic+delivery+of+probes.">Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes.</a> PLoS One. 5, e10459 (2010).</li><li>Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+vertebrate+53BP1:+a+major+role+in+non-homologous+end+joining+of+DNA+double+strand+breaks.">Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks.</a> DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).</li><li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+binding+protein+1+(53BP1)+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).</li><li>Valerie, K., Povirk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+mechanisms+of+mammalian+double-strand+break+repair.">Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair.</a> Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).</li><li>Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1,+a+mediator+of+the+DNA+damage+checkpoint.">53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint.</a> Science. 298, 1435-1438 (2002).</li><li>Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+checkpoint+protein+53BP1+at+DNA+breaks+involves+its+binding+to+phosphorylated+histone+H2AX.">Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX.</a> J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).</li></ol>

게놈 무결성의 유지 관리 세포 생존을위한 중요합니다. 조기 노화, 발암 또는 사망 8 게놈 결과를 보존 실패했습니다. 안목에 강렬한 관심이 얼마나 기본 및 임상 모두 연구의 중요성에서 형태소 분석 DDR 기능. 대부분의 기술은 세포가 감지하고 DNA 손상을 복구하는 방법의 연구에 도움이 년 동안 개발되었습니다. 기술의 최근 진보가 점점 더 정교한 방법이 진화 할 수는 않았지만 blotting 등...

<table border="1"><tbody><tr><td> 생성물 </td><td> 회사 </td></tr><tr><td> CellStar 문화 요리 </td><td> Greiner 바이오 - 원 </td></tr><tr><td> FluroDish 유리 바닥 요리 </td><td> 세계 정밀 기기 주식회사 </td></tr><tr><td> 가상 미디어 </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> 비 필수 아미노산 </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> 아미노산 </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> 비타민 </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> 나트륨 Pyruvate </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-Myc-53BP1 WT pLPC - Puro, 플라스미드 19836 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> pCLNR - H2BG, 플라스미드 17735 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> SuperFect </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Zeiss 셀 옵저버 SD 이미징 시스템 </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> AxioVision (릴리스 4.8.2) </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Zeiss Immersol W 오일 </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Volocity 소프트웨어 (버전 6.0) </td><td> PerkinElmer </td></tr></tbody></table>

two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins

두 번 스트랜드 바꿈이 (DSBs) 가장 해로운 DNA 아르 것은 셀 발생할 수 있습니다 병변. unrepaired 왼쪽 경우, DSBs 항구 잠재력은 돌연변이와 염색체 aberrations 하나를 생성합니다. DSBs을 감지하는 세포가 DNA 손상 반응 (DDR)을 활성화하고, DNA를 수리에 대한 게놈 불안정성을 catalyzing에서이 외상을 방지하기 위해, 그것은 매우 중요합니다. 자극하면, DDR 수리가 이루어 또는 apoptosis를 받아야하는 셀을 강제 할 수 있도록 세포주기의 체포를 실행하여 게놈 무결성을 유지하기 위해 노력하고 있습니다. DSB 수리의 주된 메커니즘은 nonhomologous 최종 입사 (NHEJ) 및 동종 재조합 수리 (HRR) (2에서 검토)를 통해 발생합니다. 그의 활동을 정확하게 DDR가 제대로 작동 할 수 있도록 조정해야합니다 많은 단백질이 있습니다. 이러한 단백질 중 하나 53BP1의 3 차원 (D) 시각화 - 여기, 우리는 2에 대한 방법을 설명합니다. p53의 결합 단백질 1 (53BP1는)의 영역에 localizes5-15분 5에서 foci를 형성, 수정 histones 3,4에 바인딩하여 DSBs. DSB 사이트에 53BP1 및 기타 DDR 단백질의 히스톤 수정 및 채용은 피해 지역 주변 염색질의 구조 다시 정리하기를 촉진하고 DNA 복구 6 기여할 것으로되어 있습니다. 수리에 직접 참여 외에도 추가 역할은 이러한 내부-S 검사 점 (Checkpoint), G2 / M 검문소를 조절하고 하류 DDR 단백질에게 7-9 활성화로 DDR에 53BP1에 대해 설명되어 있습니다. 최근,이 53BP1 대신 DSBs 6 근처에 로컬 라이즈하기 전에 G1를 입력 할 셀을 기다리고, 유사 분열 동안 유도 DNA 손상에 대한 응답으로 foci를 형성하지 않는 것을 발견했습니다. 같은 53BP1 등의 DDR 단백질은 세포의 유사 분열부터 10까지 진행하는 동안 mitotic 구조 (예 : kinetochores 등)과 연관이 발견되었습니다. 이 프로토콜에서 우리는 (2)의 사용을 설명 - 3-D 라이브 세포 이미징은 시각화하는DNA 손상 대리인 camptothecin (CPT)뿐만 아니라, 유사 분열 동안 53BP1의 행동에 대응 53BP1 foci의 형성. Camptothecin는 주로​​ DNA 복제 동안 DSBs의 원인이 제가 억제제가 topoisomerase입니다. 이 작업을 수행하기 위해, 우리는 이전에 설명 53BP1 - mCherry 형광 융합 단백질은 DSBs 11 바인딩 할 수 53BP1 단백질 도메인으로 구성을 구성했습니다. 또한, 우리는 히스톤 H2B-GFP 형광 융합 단백질은 세포의 유사 분열 12시 세포주기에 걸쳐 있지만, 특히 염색질 역학을 모니터링 할 수 구성 사용됩니다. 여러 차원에서 라이브 셀 이미징은 진핵 세포의 DDR 단백질의 기능에 대한 우리의 이해를 깊게 할 수있는 훌륭한 도구입니다.

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Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

이 프로토콜은 DNA 손상뿐만 아니라 유사 분열 동안의 현지화에 대한 응답으로 활성화 DNA 이중 가닥 브레이크 신호 단백질을 시각화하는 방법을 설명합니다.

DNA의 손상 응답 단백질의 2와 3 차원 라이브 셀 이미징

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

입체 세포 배양을위한 칩 크기의 공사장 공중 발판의 Microfabrication

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

연구

생물학

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

이미징 불일치 복구 및 DNA의 손상 세포 응답 바실러스 subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

COS - 7 형광 라벨링는 라이브 셀 이미징에 대한 SNAP - 태그 퓨전 단백질 표현

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

라이브 Zebrafish 태아에서 두 광자 기반 Photoactivati​​on

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

에 GFP-라벨 단백질의 영상을 라​​이브<em&gt; Drosophila</em&gt; Oocytes

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

에 대한 마우스 태아의 전체 소장 문화 시스템<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 신호 전달 경로와 융모 개발의 3 차원 라이브 영상의 조작

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

3 차원 히드로 겔의 이미지를 FRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-지우기: 조직 지방 조직의 3 차원 이미징 방법 삭제

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...