Name: two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins
Uploaded: 2012-09-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins at JoVE.com

Støttes delvis av R01NS064593 og R21ES016636 (KV). Mikroskopi ble utført ved VCU - Institutt for nevrobiologi og anatomi Mikroskopi Facility, støttet, delvis med støtte fra NIH-NINDS senter kjerne stipend 5P30NS047463. Den roterende disk confocal mikroskop ble kjøpt med en NIH-NCRR award (1S10RR027957).

A. celleforberedelsen <ol><li> Normale primære fibroblaster (GM02270) ble hentet fra Coriell Cell Repository, Camden, New Jersey, og foreviget med hTERT 6. Cellene ble dyrket og utvidet i CellStar 6-cm retter i media (4 ml) som består av MEM supplert med 20% føtalt bovint serum (Gibco), non-essential/essential aminosyrer, vitaminer, natrium pyruvat, og penicillin / streptomycin (HyClone ). </li><li> Humane embryonale nyre 293 (HEK293) celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection og dyrket og ...

<ol>
	<li>Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+methylation+state-specific+recognition+of+histone+H4-K20+by+53BP1+and+Crb2+in+DNA+repair.">Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair.</a> Cell. 127, 1361-1373 (2006).</li><li>Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+promotes+non-homologous+end+joining+of+telomeres+by+increasing+chromatin+mobility.">53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility.</a> Nature. 456, 524-528 (2008).</li><li>Feuerhahn, S., Egly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+study+DNA+repair:+what's+in+the+box.">Tools to study DNA repair: what's in the box.</a> Trends Genet. 24, 467-474 (2008).</li><li>Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+signaling+in+response+to+double-strand+breaks+during+mitosis.">DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis.</a> J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).</li><li>Giunta, S., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Give+me+a+break,+but+not+in+mitosis:+the+mitotic+DNA+damage+response+marks+DNA+double-strand+breaks+with+early+signaling+events.">Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events.</a> Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).</li><li>Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-survival+AKT+and+ERK+signaling+from+EGFR+and+mutant+EGFRvIII+enhances+DNA+double-strand+break+repair+in+human+glioma+cells.">Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells.</a> Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).</li><li>Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylated+lysine+79+of+histone+H3+targets+53BP1+to+DNA+double-strand+breaks.">Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks.</a> Nature. 432, 406-411 (2004).</li><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease.">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461, 1071-1078 (2009).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).</li><li>Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+fluorescence+imaging+of+live+cells+by+effective+cytosolic+delivery+of+probes.">Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes.</a> PLoS One. 5, e10459 (2010).</li><li>Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+vertebrate+53BP1:+a+major+role+in+non-homologous+end+joining+of+DNA+double+strand+breaks.">Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks.</a> DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).</li><li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+binding+protein+1+(53BP1)+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).</li><li>Valerie, K., Povirk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+mechanisms+of+mammalian+double-strand+break+repair.">Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair.</a> Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).</li><li>Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1,+a+mediator+of+the+DNA+damage+checkpoint.">53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint.</a> Science. 298, 1435-1438 (2002).</li><li>Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+checkpoint+protein+53BP1+at+DNA+breaks+involves+its+binding+to+phosphorylated+histone+H2AX.">Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX.</a> J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).</li></ol>

Vedlikehold av genomisk integritet er avgjørende for celle overlevelse. Unnlatelse av å bevare genom resultater i for tidlig aldring, kreft eller død 8. Det er stor interesse i kresne hvordan DDR funksjoner, som stammer fra dens betydning for både grunnforskning og klinisk forskning. Mange teknikker har blitt utviklet gjennom årene for å hjelpe i studiet av hvordan celler oppdage og reparere DNA-skader. Tradisjonelle metoder som immunocytokjemi og vestlige blotting har vært bærebjelkene i feltet, men ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Produktet </td><td> Selskapet </td></tr><tr><td> CellStar kultur retter </td><td> Greiner Bio-One </td></tr><tr><td> FluroDish glassbunn retter </td><td> Verden Precision Instruments, Inc. </td></tr><tr><td> MEM media </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Ikke-essensielle aminosyrer </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Aminosyrer </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Vitaminer </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Sodium Pyruvat </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Penicillin / streptomycin </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> Føtalt bovint serum </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; plasmid 19836 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> pCLNR-H2BG; plasmid 17735 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> SuperFect </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Zeiss Cell Observer SD Imaging system </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> AxioVision (release 4.8.2) </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Zeiss Immersol W Oil </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Volocity programvare (versjon 6.0) </td><td> PerkinElmer </td></tr></tbody></table>

two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins

Double-tråd pauser (DSBs) er den mest skadelige DNA lesjoner en celle kan støte på. Hvis venstre unrepaired, til DSBs havn stort potensial generere mutasjoner og kromosomabberasjoner en. For å forhindre dette traumer fra katalyserende genomisk ustabilitet, er det avgjørende for cellene å oppdage DSBs, aktivere DNA skade respons (DDR), og reparere DNA. Når stimulert, fungerer DDR å bevare genomisk integritet ved å utløse cellesyklus å tillate reparasjon å finne sted eller tvinge cellen til å gjennomgå apoptose. De dominerende mekanismer for DSB reparasjon skje gjennom ikkehomologe end-delta (NHEJ) og homolog rekombinasjon reparasjon (HRR) (anmeldt i 2). Det er mange proteiner hvis aktiviteter må være nøyaktig orkestrert for DDR å fungere skikkelig. Heri, beskriver vi en fremgangsmåte for 2 - og 3-dimensjonale (D) visualisering av en av disse proteinene, 53BP1. P53-bindende protein 1 (53BP1) lokaliserer til områder avDSBs ved binding til endrede histoner 3,4, forming foci innen 5-15 minutter 5. De histonmodifikasjonene og rekruttering av 53BP1 og andre DDR proteiner til DSB områder antas å lette de strukturelle omleggingen av kromatin rundt områder av skade og bidra til DNA-reparasjon 6. Utover direkte deltakelse i reparasjon, har flere roller er beskrevet for 53BP1 i DDR, som regulerer en intra-S sjekkpunkt, en G2 / M sjekkpunkt, og aktivere nedstrøms DDR proteiner 7-9. Nylig ble det oppdaget at 53BP1 ikke danner foci i respons til DNA-skade indusert ved mitose, istedenfor å vente på celler å angi G1 før lokalisere til nærhet av DSBs 6. DDR proteiner som 53BP1 har blitt funnet til å assosiere med mitotiske strukturer (for eksempel kinetochores) under progresjon gjennom mitose 10. I denne protokollen beskriver vi bruk av 2 - og 3-D live celle imaging å visualiseredannelsen av 53BP1 foci i respons til DNA-skade agenten camptothecin (CPT), samt 53BP1 oppførsel under mitose. Camptothecin er en topoisomerase I-inhibitor som primært forårsaker DSBs under DNA replikasjon. For å oppnå dette, brukte vi en tidligere beskrevet 53BP1-mCherry fluorescerende fusjonsprotein konstruere består av en 53BP1 protein domene stand til å binde DSBs 11. I tillegg brukte vi en histone H2B-GFP fluorescerende fusjonsprotein konstruere stand til å overvåke kromatin dynamikk gjennom hele cellesyklus, men særlig under mitose 12. Levende celle bildebehandling i flere dimensjoner er et utmerket verktøy for å utdype vår forståelse av funksjon av DDR proteiner i eukaryote celler.

Watch this Scientific Journal Video about Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins at JoVE.com

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for å visualisere en DNA dobbel tråd pause signal protein aktiveres i respons til DNA-skade, så vel som dens lokalisering under mitose.

To-og tre-dimensjonale Live-Cell Imaging av DNA Damage Response Proteiner

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Lever Imaging av GFP-merket Proteiner i<em&gt; Drosophila</em&gt; Oocytter

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mus Fetal Hele tarmen Kultur System for<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Manipulering av signalveier og tredimensjonale Levende Imaging av Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

FRET Imaging i Tredimensjonal Hydrogeler

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-Clear: En vev fjerne metoden for tredimensjonale Imaging av fettvev

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...