Name: two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins
Uploaded: 2012-09-28T12:00:00
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Suportado em parte pela R01NS064593 e R21ES016636 (KV). Microscopia foi realizada no VCU - Departamento de Neurobiologia e Anatomia Facilidade Microscopia, suportado, em parte, com recursos do NIH-NINDS Centro núcleo concessão 5P30NS047463. O microscópio confocal disco giratório foi comprado com um prêmio NIH-NCRR (1S10RR027957).

A. Preparação celular <ol><li> Fibroblastos humanos normais primárias (GM02270) foram obtidos a partir do Repositório Coriell Cell, Camden, New Jersey, e imortalizadas com hTERT 6. As células foram cultivadas e expandidas em CellStar 6 cm de pratos no meio (4 ml) que consistem em MEM suplementado com 20% soro fetal bovino (GIBCO), non-essential/essential aminoácidos, vitaminas, piruvato de sódio, e penicilina / estreptomicina (HyClone ). </li><li> Rim embrionário humano 293 (HEK293) as células fora...

<ol>
	<li>Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+methylation+state-specific+recognition+of+histone+H4-K20+by+53BP1+and+Crb2+in+DNA+repair.">Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair.</a> Cell. 127, 1361-1373 (2006).</li><li>Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+promotes+non-homologous+end+joining+of+telomeres+by+increasing+chromatin+mobility.">53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility.</a> Nature. 456, 524-528 (2008).</li><li>Feuerhahn, S., Egly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+study+DNA+repair:+what's+in+the+box.">Tools to study DNA repair: what's in the box.</a> Trends Genet. 24, 467-474 (2008).</li><li>Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+signaling+in+response+to+double-strand+breaks+during+mitosis.">DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis.</a> J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).</li><li>Giunta, S., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Give+me+a+break,+but+not+in+mitosis:+the+mitotic+DNA+damage+response+marks+DNA+double-strand+breaks+with+early+signaling+events.">Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events.</a> Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).</li><li>Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-survival+AKT+and+ERK+signaling+from+EGFR+and+mutant+EGFRvIII+enhances+DNA+double-strand+break+repair+in+human+glioma+cells.">Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells.</a> Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).</li><li>Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylated+lysine+79+of+histone+H3+targets+53BP1+to+DNA+double-strand+breaks.">Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks.</a> Nature. 432, 406-411 (2004).</li><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease.">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461, 1071-1078 (2009).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).</li><li>Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+fluorescence+imaging+of+live+cells+by+effective+cytosolic+delivery+of+probes.">Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes.</a> PLoS One. 5, e10459 (2010).</li><li>Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+vertebrate+53BP1:+a+major+role+in+non-homologous+end+joining+of+DNA+double+strand+breaks.">Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks.</a> DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).</li><li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+binding+protein+1+(53BP1)+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).</li><li>Valerie, K., Povirk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+mechanisms+of+mammalian+double-strand+break+repair.">Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair.</a> Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).</li><li>Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1,+a+mediator+of+the+DNA+damage+checkpoint.">53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint.</a> Science. 298, 1435-1438 (2002).</li><li>Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+checkpoint+protein+53BP1+at+DNA+breaks+involves+its+binding+to+phosphorylated+histone+H2AX.">Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX.</a> J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).</li></ol>

Manutenção da integridade do genoma é essencial para a sobrevivência da célula. A falta de preservar os resultados do genoma em envelhecimento prematuro, carcinogênese, a morte ou 8. Há um grande interesse em discernir como as funções de DDR, decorrentes da sua importância para a pesquisa básica e clínica. Muitas técnicas têm sido desenvolvidas ao longo dos anos para ajudar no estudo de como as células detectar e reparar danos no DNA. Métodos tradicionais, como imunocitoquímica e western blot...

<table border="1"><tbody><tr><td> Produto </td><td> Companhia </td></tr><tr><td> Cultura pratos CellStar </td><td> Greiner Bio-One </td></tr><tr><td> Pratos de vidro de fundo FluroDish </td><td> Precision mundo Instruments, Inc. </td></tr><tr><td> MEM mídia </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Não-aminoácidos essenciais </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Aminoácidos </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Vitaminas </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Piruvato de sódio </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> Soro Fetal Bovino </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; 19836 plasmídeo </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> pCLNR-H2BG; 17735 plasmídeo </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> SuperFect </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Celular Zeiss Observer SD Imaging System </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> AxioVision (versão 4.8.2) </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Zeiss Immersol W óleo </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Volocity software (versão 6.0) </td><td> PerkinElmer </td></tr></tbody></table>

two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins

Duplo-strand breaks (LAP) são o DNA mais deletéria lesões uma célula pode encontrar. Se deixado sem reparos, DSBs potencial grande porto para gerar mutações e aberrações cromossômicas 1. Para evitar este trauma de catalisar a instabilidade genômica, é crucial para que as células detectam DSBs, ativar a resposta de danos no DNA (DDR), e reparar o DNA. Quando estimulado, o DDR trabalha para preservar a integridade genómica, desencadeando paragem do ciclo celular para permitir a reparação para ter lugar ou forçar a célula a apoptose. Os mecanismos predominantes de reparação de DSB de ocorrer através da extremidade não homóloga-joining (NHEJ) e homóloga recombinação reparação (HRR) (revista em 2). Há muitas proteínas cujas atividades devem ser precisamente orquestrada para a DDR para funcionar corretamente. Relata-se um método para a 2 - e 3-dimensional de visualização (D) de uma destas proteínas, 53BP1. A proteína p53 de ligação 1 (53BP1) localiza a áreas deDSBs ligando-se a histonas modificadas 3,4, formando focos dentro de 5-15 minutos 5. As modificações de histonas e recrutamento de proteínas e de outros 53BP1 DDR para locais DSB são acreditados para facilitar o rearranjo estrutural da cromatina em torno das áreas de danos e de contribuir para a reparação do ADN 6. Além da participação direta na reparação, funções adicionais têm sido descritos para 53BP1 no DDR, como regular um posto de controle intra-S, um checkpoint G2 / M, e ativar proteínas jusante DDR 7-9. Recentemente, descobriu-se que não se forma 53BP1 focos em resposta ao dano do DNA induzido durante a mitose, em vez de espera para as células antes de introduzir a localização de G1 para a vizinhança de DSBs 6. Proteínas, tais como DDR 53BP1 foram encontrados para associar com estruturas de mitose (por exemplo, cinetocoros), durante a progressão através da mitose 10. Neste protocolo, descrevemos o uso de 2 - e 3-D imagens de células vivas para visualizara formação de focos 53BP1, em resposta ao agente danificador de ADN camptotecina (CPT), bem como o comportamento 53BP1 durante a mitose. A camptotecina é um inibidor da topoisomerase I, que provoca principalmente DSBs durante a replicação do ADN. Para conseguir isto, foi utilizado um anteriormente descrito 53BP1-mCherry proteína de fusão que consiste em fluorescente construir um domínio de proteína capaz de se ligar 53BP1 DSBs 11. Além disso, utilizou-se uma histona H2B-GFP fluorescente construir a proteína de fusão capaz de controlar a dinâmica da cromatina ao longo do ciclo celular, mas em particular durante a mitose 12. Imagens de células vivas em múltiplas dimensões é uma excelente ferramenta para aprofundar nossa compreensão da função de proteínas DDR em células eucarióticas.

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Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Este protocolo descreve um método para a visualização de um DNA double-strand proteína quebra de sinalização activada em resposta a danos no ADN, bem como sua localização durante a mitose.

Duas e três dimensões imagens de células vivas de Proteínas de DNA resposta a danos

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Research

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Biology

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