Name: two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins
Uploaded: 2012-09-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins at JoVE.com

При частичной поддержке R01NS064593 и R21ES016636 (KV). Микроскопия была выполнена в VCU - отдел фонда микроскопии нейробиологии и анатомии, поддерживается, в частности, с финансированием из NIH-NINDS центра основного гранта 5P30NS047463. Вращающийся диск конфокальной микроскопии был приобретен с NIH-NCRR премии (1S10RR027957).

А. клеточный препарат <ol><li> Нормальные человеческие первичных фибробластов (GM02270) были получены от Coriell сотовых Repository, Камден, Нью-Джерси, и увековечил с hTERT 6. Клетки выращивались и расширена в Cellstar 6-см блюд в средствах массовой информации (4 мл), состоящий из MEM с добавлением 20% эмбри...

<ol>
	<li>Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+methylation+state-specific+recognition+of+histone+H4-K20+by+53BP1+and+Crb2+in+DNA+repair.">Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair.</a> Cell. 127, 1361-1373 (2006).</li><li>Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+promotes+non-homologous+end+joining+of+telomeres+by+increasing+chromatin+mobility.">53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility.</a> Nature. 456, 524-528 (2008).</li><li>Feuerhahn, S., Egly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+study+DNA+repair:+what's+in+the+box.">Tools to study DNA repair: what's in the box.</a> Trends Genet. 24, 467-474 (2008).</li><li>Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+signaling+in+response+to+double-strand+breaks+during+mitosis.">DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis.</a> J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).</li><li>Giunta, S., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Give+me+a+break,+but+not+in+mitosis:+the+mitotic+DNA+damage+response+marks+DNA+double-strand+breaks+with+early+signaling+events.">Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events.</a> Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).</li><li>Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-survival+AKT+and+ERK+signaling+from+EGFR+and+mutant+EGFRvIII+enhances+DNA+double-strand+break+repair+in+human+glioma+cells.">Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells.</a> Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).</li><li>Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylated+lysine+79+of+histone+H3+targets+53BP1+to+DNA+double-strand+breaks.">Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks.</a> Nature. 432, 406-411 (2004).</li><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease.">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461, 1071-1078 (2009).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).</li><li>Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+fluorescence+imaging+of+live+cells+by+effective+cytosolic+delivery+of+probes.">Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes.</a> PLoS One. 5, e10459 (2010).</li><li>Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+vertebrate+53BP1:+a+major+role+in+non-homologous+end+joining+of+DNA+double+strand+breaks.">Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks.</a> DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).</li><li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+binding+protein+1+(53BP1)+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).</li><li>Valerie, K., Povirk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+mechanisms+of+mammalian+double-strand+break+repair.">Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair.</a> Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).</li><li>Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1,+a+mediator+of+the+DNA+damage+checkpoint.">53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint.</a> Science. 298, 1435-1438 (2002).</li><li>Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+checkpoint+protein+53BP1+at+DNA+breaks+involves+its+binding+to+phosphorylated+histone+H2AX.">Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX.</a> J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).</li></ol>

Поддержание целостность генома имеет решающее значение для выживания клеток. Неспособность сохранить геном приводит к преждевременному старению, канцерогенеза, или смерть 8. Существует повышенный интерес взыскательных как DDR функций, вытекающих из его значение как фундаментал?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Продукт </td><td> Компания </td></tr><tr><td> Блюда Cellstar культуры </td><td> Greiner Bio-One </td></tr><tr><td> FluroDish блюда со стеклянным дном </td><td> Всемирный Precision Instruments, Inc </td></tr><tr><td> MEM СМИ </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Номера для незаменимых аминокислот </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Аминокислоты </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Витамины </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Пируват натрия </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Пенициллина / стрептомицина </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> Плод бычьего сывороточного </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; плазмиды 19836 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> pCLNR-H2BG; плазмиды 17735 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> Superfect </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Zeiss сотовых наблюдателей SD Система визуализации </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> AxioVision (версия 4.8.2) </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Zeiss Immersol W нефти </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Volocity программного обеспечения (версия 6.0) </td><td> PerkinElmer </td></tr></tbody></table>

two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins

Двунитевых разрывов (ДР) являются наиболее вредными повреждения ДНК клетки может столкнуться. Если оставить неустраненные, DSBs гавани большой потенциал для создания мутаций и хромосомных аберраций 1. Чтобы предотвратить эту травму от катализирующих геномной нестабильности, крайне важно для клеток для обнаружения DSBs, активировать ответ повреждение ДНК (РДР), и ремонт ДНК. Когда стимулируются, DDR работает, чтобы сохранить целостность генома, вызывая остановку клеточного цикла, чтобы обеспечить ремонт пройдет или заставить клетки к апоптозу. Преобладающий механизм ремонта DSB происходить через негомологичных конце-присоединение (NHEJ) и гомологичной рекомбинации ремонт (HRR) (отзывы в 2). Есть много белков, чья деятельность должна быть четко организованы для DDR функционировать должным образом. Здесь мы опишем метод для 2 - и 3-мерные (D) визуализация одного из этих белков, 53BP1. P53-связывающий белок 1 (53BP1) локализуется в областиDSBs путем связывания изменение гистонов 3,4, образуя очаги в течение 5-15 минут 5. Модификации гистонов и вербовки 53BP1 и других белков DDR для DSB сайтов, как полагают, содействие структурной перестройке хроматина вокруг области повреждения и способствуют репарации ДНК 6. Помимо непосредственного участия в ремонте, дополнительные роли были описаны для 53BP1 в ГДР, например, регулирование внутри-S контрольно-пропускном пункте, G2 / M контрольно-пропускного пункта, и активация белка ниже по течению DDR 7-9. Недавно было обнаружено, что 53BP1 не образует очаги в ответ на повреждение ДНК индуцированных во время митоза, вместо ожидания для клеток, чтобы войти G1 до локализации в окрестности DSBs 6. DDR белки, такие как 53BP1 были найдены общаться с митотической структур (таких, как кинетохоры) во время их прохождения митоза 10. В этом протоколе описываются использования 2 - и 3-D изображений живых клеток, чтобы визуализироватьформирование 53BP1 очагов в ответ на ДНК-повреждающих агентов камптотецин (CPT), а также поведение 53BP1 во время митоза. Камптотецин является ингибитором топоизомеразы I, что в первую очередь вызывает DSBs во время репликации ДНК. Для этого мы использовали ранее описанных 53BP1-mCherry флуоресцентный белок слияния построить, состоящий из 53BP1 домена белка способен связывать DSBs 11. Кроме того, мы использовали гистона H2B-GFP флуоресцентный белок слияния построить в состоянии контролировать динамику хроматина протяжении клеточного цикла, но, в частности, во время митоза 12. Изображений живых клеток в нескольких измерениях является отличным инструментом для углубления нашего понимания функции белков DDR в эукариотических клетках.

Watch this Scientific Journal Video about Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins at JoVE.com

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Этот протокол описывает метод визуализации ДНК двухцепочечной перерыв сигнальный белок активируется в ответ на повреждения ДНК, а также его локализации во время митоза.

Двух-и трехмерных изображений живых клеток ДНК, белков реакции на повреждения

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Микротехнологий из Чип размером Строительные леса для трехмерного клеточного культивирования

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Двухфотонное axotomy и покадровой конфокальной микроскопии в живых эмбрионов данио рерио

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Живая съемка Дрозофилы Эмбриональные миграции гемоцитов

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Несоответствие изображений Ремонт и клеточных реакций на повреждение ДНК в Сенная Bacillus</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Флуоресцентная маркировка COS-7 выражая SNAP-теги Белки Fusion для живых изображений сотовый

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Два-Фотон основе Фотоактивация в Живом данио рерио Эмбрионы

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Жить Визуализация GFP-меченых белков в<em&gt; Drosophila</em&gt; Ооцитов

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Мышь плода Всего кишка Культура Система для<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Манипуляция сигнальных путей и трехмерных живых изображений развития ворсинки

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

FRET визуализации в трехмерных гидрогелей

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

ADIPO ясно: Ткани, очистка метод для трехмерных изображений жировой ткани

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...