Name: two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins
Uploaded: 2012-09-28T12:00:00
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Apoyado en parte por R01NS064593 y R21ES016636 (KV). Microscopía se realizó en la UCV - Departamento de Servicio de Microscopía Neurobiología y Anatomía, apoyada, en parte, con fondos del NIH NINDS subvención 5P30NS047463 Center núcleo. El microscopio confocal de disco giratorio se compró con un premio NIH-CNRR (1S10RR027957).

A. Preparación de la célula <ol><li> Fibroblastos humanos normales primarios (GM02270) se obtuvieron de Coriell Cell Repository, Camden, Nueva Jersey, y se inmortalizan con hTERT 6. Las células se hicieron crecer y se expandieron en CellStar 6 cm de platos en los medios de comunicación (4 ml) que consiste en MEM suplementado con 20% fetal suero bovino (GIBCO), non-essential/essential aminoácidos, vitaminas, piruvato de sodio, y penicilina / estreptomicina (HyClone ). </li><li> De riñón embrionario hu...

<ol>
	<li>Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+methylation+state-specific+recognition+of+histone+H4-K20+by+53BP1+and+Crb2+in+DNA+repair.">Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair.</a> Cell. 127, 1361-1373 (2006).</li><li>Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+promotes+non-homologous+end+joining+of+telomeres+by+increasing+chromatin+mobility.">53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility.</a> Nature. 456, 524-528 (2008).</li><li>Feuerhahn, S., Egly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+study+DNA+repair:+what's+in+the+box.">Tools to study DNA repair: what's in the box.</a> Trends Genet. 24, 467-474 (2008).</li><li>Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+signaling+in+response+to+double-strand+breaks+during+mitosis.">DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis.</a> J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).</li><li>Giunta, S., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Give+me+a+break,+but+not+in+mitosis:+the+mitotic+DNA+damage+response+marks+DNA+double-strand+breaks+with+early+signaling+events.">Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events.</a> Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).</li><li>Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-survival+AKT+and+ERK+signaling+from+EGFR+and+mutant+EGFRvIII+enhances+DNA+double-strand+break+repair+in+human+glioma+cells.">Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells.</a> Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).</li><li>Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylated+lysine+79+of+histone+H3+targets+53BP1+to+DNA+double-strand+breaks.">Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks.</a> Nature. 432, 406-411 (2004).</li><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease.">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461, 1071-1078 (2009).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).</li><li>Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+fluorescence+imaging+of+live+cells+by+effective+cytosolic+delivery+of+probes.">Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes.</a> PLoS One. 5, e10459 (2010).</li><li>Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+vertebrate+53BP1:+a+major+role+in+non-homologous+end+joining+of+DNA+double+strand+breaks.">Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks.</a> DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).</li><li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+binding+protein+1+(53BP1)+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).</li><li>Valerie, K., Povirk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+mechanisms+of+mammalian+double-strand+break+repair.">Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair.</a> Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).</li><li>Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1,+a+mediator+of+the+DNA+damage+checkpoint.">53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint.</a> Science. 298, 1435-1438 (2002).</li><li>Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+checkpoint+protein+53BP1+at+DNA+breaks+involves+its+binding+to+phosphorylated+histone+H2AX.">Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX.</a> J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).</li></ol>

Mantenimiento de la integridad genómica es crucial para la supervivencia celular. El incumplimiento de preservar los resultados del genoma en el envejecimiento prematuro, la carcinogénesis, o la muerte 8. Hay un gran interés en discernir cómo funciona el DDR, derivadas de su importancia para la investigación básica y clínica. Muchas técnicas se han desarrollado a lo largo de los años para ayudar en el estudio de cómo las células detectar y reparar el daño del ADN. Los métodos tradicionales como l...

<table border="1"><tbody><tr><td> Producto </td><td> Empresa </td></tr><tr><td> Cellstar placas de cultivo </td><td> Greiner Bio-One </td></tr><tr><td> FluroDish platos con fondo de cristal </td><td> World Precision Instruments, Inc. </td></tr><tr><td> Medio MEM </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> No esenciales de aminoácidos </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Los aminoácidos </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Vitaminas </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Piruvato de sodio </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Penicilina / Estreptomicina </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> Suero Bovino Fetal </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-Myc-53BP1 PESO pLPC-Puro; plásmido 19836 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> pCLNR-H2BG; plásmido 17735 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> SuperFect </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Zeiss celular Observador SD Imaging System </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> AxioVision (versión 4.8.2) </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Zeiss Immersol W Petróleo </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Volocity software (versión 6,0) </td><td> PerkinElmer </td></tr></tbody></table>

two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins

Doble filamento se rompe (DSBs) son el ADN más perjudicial lesiones que una célula pueda encontrar. Si se deja sin reparar, DSBs gran puerto potencial para generar mutaciones y aberraciones cromosómicas 1. Para evitar este trauma de catalizar la inestabilidad genómica, que es crucial para las células para detectar DSBs, activan la respuesta al daño del ADN (DDR), y reparar el ADN. Cuando se estimula, el DDR trabaja para preservar la integridad genómica mediante la activación de detención del ciclo celular para permitir la reparación a tener lugar o forzar la célula a la apoptosis. Los mecanismos predominantes de reparación de DSB ocurrir a través de nonhomologous fin de unirse (NHEJ) y reparación de recombinación homóloga (HRR) (revisado en 2). Hay muchas proteínas cuyas actividades deben estar precisamente orquestada por la RDA para funcionar correctamente. En este documento, se describe un método para 2 - y 3-dimensional (D) la visualización de una de estas proteínas, 53BP1. La proteína p53 de unión 1 (53BP1) se localiza en áreas deDSBs por la unión a las histonas modificadas 3,4, formando focos dentro de 5-15 minutos 5. Las modificaciones de las histonas y el reclutamiento de proteínas DDR 53BP1 y otro a sitios de DSB se cree que facilita la reorganización estructural de la cromatina alrededor de las áreas de daño y contribuir a la reparación del ADN 6. Más allá de la participación directa en la reparación, funciones adicionales han sido descritos para 53BP1 en el DDR, tales como la regulación de un puesto de control intra-S, un punto de control G2 / M, y la activación de proteínas aguas abajo de DDR 7-9. Recientemente, se descubrió que 53BP1 no formar focos en respuesta al daño del ADN inducido durante la mitosis, en vez de espera para entrar en las células G1 antes de localizar a la vecindad de DSBs 6. Proteínas tales como DDR 53BP1 han encontrado asociación con estructuras mitóticas (tal como cinetocoros) durante la progresión a través de mitosis 10. En este protocolo se describe el uso de 2 - y 3-D imágenes de células vivas para visualizarla formación de focos 53BP1 en respuesta al agente que daña el ADN camptotecina (CPT), así como el comportamiento de 53BP1 durante la mitosis. La camptotecina es un inhibidor de topoisomerasa I que causa principalmente DSBs durante la replicación del ADN. Para lograr esto, se utilizó una anteriormente descrita 53BP1-mCherry proteína de fusión fluorescente construir consta de un dominio de proteína 53BP1 capaz de unirse DSBs 11. Además, se utilizó una histona H2B-GFP proteína de fusión fluorescente construir capaz de monitorear dinámica de la cromatina a través del ciclo celular, pero en particular durante la mitosis 12. Imágenes de células vivas en múltiples dimensiones es una excelente herramienta para profundizar en nuestra comprensión de la función de las proteínas de DDR en las células eucariotas.

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Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Este protocolo describe un método para visualizar un ADN de doble hebra proteína rotura de señalización activada en respuesta al daño del ADN, así como su localización durante la mitosis.

De dos y tres dimensiones imágenes de células vivas de las proteínas de respuesta al daño del ADN

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Microfabricación de chip del tamaño de andamios para el cultivo de células en tres dimensiones

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Investigación

Biología

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

De dos fotones axotomía y de lapso de tiempo de imagen confocal en embriones de pez cebra en vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

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Imágenes en directo de Drosophila melanogaster Migraciones hemocitos embrionarias

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

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Imágenes de reparación del ADN y la respuesta celular al daño del ADN en Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Marcaje fluorescente de COS-7 Expresando etiqueta SNAP-proteínas de fusión de imágenes de células vivas

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

De dos fotones basado en fotoactivación en vivo embriones de pez cebra

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Imágenes en directo de las proteínas GFP-etiquetados en<em&gt; Drosophila</em&gt; Los ovocitos

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

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Sistema de Cultura ratón fetal Whole Intestino para<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Manipulación de vías de señalización y tridimensional de imágenes en vivo del desarrollo de vellosidades

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

FRET Imaging en hidrogeles tridimensionales

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-claro: Un tejido claro método de proyección de imagen tridimensional del tejido adiposo

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