Name: two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins
Uploaded: 2012-09-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins at JoVE.com

Stöds delvis av R01NS064593 och R21ES016636 (KV). Mikroskopi utfördes vid OAV - Institutionen för neurobiologi &amp; anatomi Mikroskopi Facility, som stöds delvis med finansiering från NIH-NINDS Center kärna bidrag 5P30NS047463. Den roterande skiva konfokalmikroskop köptes med en NIH-NCRR utmärkelse (1S10RR027957).

A. cellberedning <ol><li> Normala humana primära fibroblaster (GM02270) erhölls från Coriell Cell Repository, Camden, New Jersey, och immortaliseras med hTERT 6. Celler odlades och expanderades i CellStar 6-cm skålar i medier (4 ml) bestående av MEM kompletterat med 20% fetalt bovint serum (GIBCO), non-essential/essential aminosyror, vitaminer, natriumpyruvat och penicillin / streptomycin (HyClone ). </li><li> Humana embryonala njur 293 (HEK293)-celler erhölls från American Type Culture Collection oc...

<ol>
	<li>Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+methylation+state-specific+recognition+of+histone+H4-K20+by+53BP1+and+Crb2+in+DNA+repair.">Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair.</a> Cell. 127, 1361-1373 (2006).</li><li>Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+promotes+non-homologous+end+joining+of+telomeres+by+increasing+chromatin+mobility.">53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility.</a> Nature. 456, 524-528 (2008).</li><li>Feuerhahn, S., Egly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+study+DNA+repair:+what's+in+the+box.">Tools to study DNA repair: what's in the box.</a> Trends Genet. 24, 467-474 (2008).</li><li>Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+signaling+in+response+to+double-strand+breaks+during+mitosis.">DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis.</a> J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).</li><li>Giunta, S., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Give+me+a+break,+but+not+in+mitosis:+the+mitotic+DNA+damage+response+marks+DNA+double-strand+breaks+with+early+signaling+events.">Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events.</a> Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).</li><li>Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-survival+AKT+and+ERK+signaling+from+EGFR+and+mutant+EGFRvIII+enhances+DNA+double-strand+break+repair+in+human+glioma+cells.">Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells.</a> Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).</li><li>Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylated+lysine+79+of+histone+H3+targets+53BP1+to+DNA+double-strand+breaks.">Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks.</a> Nature. 432, 406-411 (2004).</li><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease.">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461, 1071-1078 (2009).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).</li><li>Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+fluorescence+imaging+of+live+cells+by+effective+cytosolic+delivery+of+probes.">Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes.</a> PLoS One. 5, e10459 (2010).</li><li>Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+vertebrate+53BP1:+a+major+role+in+non-homologous+end+joining+of+DNA+double+strand+breaks.">Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks.</a> DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).</li><li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+binding+protein+1+(53BP1)+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).</li><li>Valerie, K., Povirk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+mechanisms+of+mammalian+double-strand+break+repair.">Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair.</a> Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).</li><li>Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1,+a+mediator+of+the+DNA+damage+checkpoint.">53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint.</a> Science. 298, 1435-1438 (2002).</li><li>Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+checkpoint+protein+53BP1+at+DNA+breaks+involves+its+binding+to+phosphorylated+histone+H2AX.">Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX.</a> J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).</li></ol>

Underhåll av genomisk integritet är avgörande för cellens överlevnad. Underlåtenhet att bevara genomet resulterar i för tidigt åldrande, cancer eller död 8. Det är intensivt intresse för kräsna hur DDR funktioner, som härrör från dess betydelse för både grundforskning och klinisk forskning. Många tekniker har utvecklats under åren för att hjälpa till vid studiet av hur celler upptäcka och reparera DNA-skador. Traditionella metoder som immuncytokemi och Western blotting har varit hörnste...

<table border="1"><tbody><tr><td> Produkt </td><td> Företag </td></tr><tr><td> CellStar odlingsskålar </td><td> Greiner Bio-en </td></tr><tr><td> FluroDish glas botten rätter </td><td> World Precision Instruments, Inc. </td></tr><tr><td> MEM-medium </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Icke-essentiella aminosyror </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Aminosyror </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Vitaminer </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Natrium Pyruvat </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Penicillin / streptomycin </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> Fetalt bovint serum </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; plasmid 19.836 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> pCLNR-H2BG; plasmiden 17.735 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> SuperFect </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Zeiss Cell Observer SD Imaging System </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> AxioVision (release 4.8.2) </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Zeiss Immersol W Oil </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Volocity programvara (version 6,0) </td><td> PerkinElmer </td></tr></tbody></table>

two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins

Dubbelklicka strängbrott (DSB) är den mest skadliga DNA-skador en cell kan stöta på. Om den lämnas oreparerade till DSB hamn stor potential generera mutationer och kromosomavvikelser 1. För att förhindra detta trauma från katalysera genomisk instabilitet, är det viktigt för celler att upptäcka DSB, aktiverar svaret DNA-skada (DDR), och reparera DNA. När stimuleras arbetar DDR för att bevara genomisk integritet genom att utlösa cellcykelstopp för att möjliggöra reparation att äga rum eller tvinga cellen att genomgå apoptos. De dominerande mekanismerna för DSB reparation sker genom icke-homolog slutet gå (NHEJ) och homolog rekombination reparation (HRR) (granskas 2). Det finns många proteiner vars verksamhet måste noggrant iscensatt för DDR att fungera korrekt. Häri beskriver vi en metod för 2 - och 3-dimensionella (D) visualisering av ett av dessa proteiner, 53BP1. P53-bindande protein 1 (53BP1) lokaliseras till områdenDSB genom att binda till modifierade histoner 3,4 och bildar foci inom 5-15 minuter 5. De histon modifieringar och rekrytering av 53BP1 och andra DDR proteiner till DSB sajter tros underlätta strukturella ombildning av kromatin runt områden av skador och bidra till DNA-reparation 6. Utöver direkta deltagande i reparation, har ytterligare roller beskrivits för 53BP1 i DDR, som reglerar en intra-S Checkpoint, en G2 / M Checkpoint, och aktivera nedströms DDR proteiner 7-9. Nyligen upptäcktes det att 53BP1 inte bildar foci som svar på DNA-skada inducerad under mitos, utan väntar på celler att gå in G1 innan lokalisera till närheten av DSB 6. DDR proteiner såsom 53BP1 har befunnits associera med mitotiska strukturer (såsom kinetochores) under framskridandet genom mitos 10. I detta protokoll beskriver vi användningen av 2 - och 3-D-levande cell imaging att visualiserabildandet av 53BP1 härdar som svar på DNA-skadande medlet kamptotecin (CPT), liksom 53BP1 beteende under mitos. Kamptotecin är en topoisomeras I hämmare som främst orsakar DSB under DNA-replikation. För att uppnå detta har vi använt en tidigare beskrivna 53BP1-mCherry fluorescerande fusionsprotein bygga bestående av ett 53BP1 proteindomän kan binda DSB 11. Dessutom använde vi en histon H2B-GFP fluorescerande fusionsprotein konstruera kunna övervaka kromatin dynamik i hela cellcykeln, men i synnerhet under mitos 12. Levande cell imaging i flera dimensioner är ett utmärkt verktyg för att fördjupa vår förståelse av funktionen hos DDR proteiner i eukaryota celler.

Watch this Scientific Journal Video about Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins at JoVE.com

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Detta protokoll beskriver en metod för att visualisera en DNA-dubbel-strängbrott signalsystem protein aktiveras som svar på DNA-skada samt dess lokalisering vid mitos.

Två-och tredimensionell levande cell imaging av svar DNA-skador Proteiner

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Mikrofabrikation av Chip-storlek Byggnadsställningar för tredimensionell cellodling

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Två-foton axotomy och Time-lapse konfokala imaging i levande zebrafisk embryon

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live avbildning av Drosophila melanogaster Embryonala Hemocyte Flyttningar

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Imaging Mismatch Reparation och cellulära svaren på DNA-skador i Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Fluorescerande märkning av COS-7 uttrycka SNAP-tagg fusionsproteiner för levande cell imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Två-foton-Based Fotoaktiveringen i Live Zebrafish embryon

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live avbildning av GFP-märkta proteiner i<em&gt; Drosophila</em&gt; Oocyter

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mus Fetal Hela tarm Kultur System för<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Manipulering av signaleringsvägar och Tredimensionell Live avbildning av Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

FRET Imaging i Tredimensionella Hydrogeler

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-Clear: En vävnad Clearing metod för tredimensionell avbildning av fettvävnad

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...