Name: two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins
Uploaded: 2012-09-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins at JoVE.com

R01NS064593 ve R21ES016636 (KV) tarafından kısmen desteklenir. Mikroskopi VCU yapıldı - Nörobiyoloji &amp; Anatomi Mikroskopi Tesis Bölümü, NIH-NINDS Merkezi çekirdek hibe 5P30NS047463 fon ile, kısmen desteklenmektedir. Dönen diske konfokal mikroskop bir NIH-NCRR ödülü (1S10RR027957) ile satın alınmıştır.

A. Hücre Hazırlanması <ol><li> Normal insan primer fibroblast (GM02270) Coriell Hücre Deposu, Camden, New Jersey, elde ve hTERT 6 ile ölümsüzleştirdi edilmiştir. Hücreler CellStar yetiştirilen ve genişletilmiştir% 20 fetal bovin serumu (Gibco), non-essential/essential amino asitler, vitaminler, sodyum piruvat, ve penisilin / streptomisin (HyClone ile desteklenmiş MEM oluşan ortam içinde, 6 cm tabaklar (4 ml) ). </li><li> İnsan embriyonik böbrek 293 (HEK293) hücreleri, American Type Cultur...

<ol>
	<li>Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+methylation+state-specific+recognition+of+histone+H4-K20+by+53BP1+and+Crb2+in+DNA+repair.">Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair.</a> Cell. 127, 1361-1373 (2006).</li><li>Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+promotes+non-homologous+end+joining+of+telomeres+by+increasing+chromatin+mobility.">53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility.</a> Nature. 456, 524-528 (2008).</li><li>Feuerhahn, S., Egly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+study+DNA+repair:+what's+in+the+box.">Tools to study DNA repair: what's in the box.</a> Trends Genet. 24, 467-474 (2008).</li><li>Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+signaling+in+response+to+double-strand+breaks+during+mitosis.">DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis.</a> J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).</li><li>Giunta, S., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Give+me+a+break,+but+not+in+mitosis:+the+mitotic+DNA+damage+response+marks+DNA+double-strand+breaks+with+early+signaling+events.">Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events.</a> Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).</li><li>Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-survival+AKT+and+ERK+signaling+from+EGFR+and+mutant+EGFRvIII+enhances+DNA+double-strand+break+repair+in+human+glioma+cells.">Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells.</a> Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).</li><li>Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylated+lysine+79+of+histone+H3+targets+53BP1+to+DNA+double-strand+breaks.">Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks.</a> Nature. 432, 406-411 (2004).</li><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease.">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461, 1071-1078 (2009).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).</li><li>Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+fluorescence+imaging+of+live+cells+by+effective+cytosolic+delivery+of+probes.">Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes.</a> PLoS One. 5, e10459 (2010).</li><li>Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+vertebrate+53BP1:+a+major+role+in+non-homologous+end+joining+of+DNA+double+strand+breaks.">Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks.</a> DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).</li><li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+binding+protein+1+(53BP1)+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).</li><li>Valerie, K., Povirk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+mechanisms+of+mammalian+double-strand+break+repair.">Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair.</a> Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).</li><li>Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1,+a+mediator+of+the+DNA+damage+checkpoint.">53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint.</a> Science. 298, 1435-1438 (2002).</li><li>Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+checkpoint+protein+53BP1+at+DNA+breaks+involves+its+binding+to+phosphorylated+histone+H2AX.">Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX.</a> J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).</li></ol>

Genomik bütünlüğünün korunması hücrenin yaşaması için önemlidir. Erken yaşlanma, karsinogenez veya ölüm 8 genom sonuçları korumak için başarısızlık. Sezmek yoğun ilgi var nasıl temel ve klinik hem de araştırma için önemini kaynaklanan DDR fonksiyonları. Birçok teknikleri hücreleri algılamak ve DNA hasarı onarmak nasıl çalışmaya yardımcı olmak için yıllar içinde geliştirilmiştir. Teknolojideki son gelişmeler giderek daha sofistike yöntemler gelişmeye izin olsa blo...

<table border="1"><tbody><tr><td> Ürün </td><td> Şirket </td></tr><tr><td> CellStar kültür tabaklarında </td><td> Greiner Bio-one </td></tr><tr><td> FluroDish cam alt yemekler </td><td> Dünya Precision Instruments, Inc </td></tr><tr><td> MEM ortam </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Non-esansiyel amino asitler </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Amino asitler </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Vitaminler </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Sodyum piruvat </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-myc-53BP1 WT pLPC-Puro; plasmid 19836 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> pCLNR-H2BG; plasmid 17735 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> SuperFect </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Zeiss Cep Gözlemci SD Görüntüleme sistemi </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> AxioVision (sürüm 4.8.2) </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Zeiss İmmersol W Yağı </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Volocity yazılımı (sürüm 6.0) </td><td> Perkin Elmer </td></tr></tbody></table>

two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins

Çift iplikli sonları (DSBs) en zararlı DNA olan bir hücre karşılaşabilirsiniz Lezyon. Onarılamayan bırakılırsa, DSBs liman büyük potansiyel mutasyonlar ve kromozomal anomaliler 1. üretmek. DSBs algılamak için hücreler, DNA hasar cevabı (DDR) etkinleştirmek ve DNA tamir için genomik instabilite katalizleyen bu travma önlemek için çok önemlidir. Uyarıldığında, DDR onarım gerçekleşecek ya da apoptoz geçmesi hücre zorlamak için izin vermek için hücre döngüsü tutuklama tetikleyerek genomik bütünlüğünü korumak için çalışır. DSB onarım baskın mekanizmaları nonhomologous sonu katılmadan (NHEJ) ve homolog rekombinasyon tamiri (HRR) (2 yorum) yoluyla meydana gelir. Olan faaliyetleri kesin DDR düzgün çalışması için düzenledi gereken pek çok protein vardır. Ve bu proteinlerin birinin, 53BP1 3-boyutlu (D) görselleştirme - Burada, bir 2 için yöntem açıklanmaktadır. P53-bağlayıcı protein 1 (53BP1) alanlarına lokalize5-15 dakika 5 içinde odaklarının oluşturulması, modifiye histon 3,4 bağlanarak DSBs. DSB sitelerine 53BP1 ve diğer DDR proteinlerin histon modifikasyonlar ve alım hasar bölgelerinin çevresinde kromatin yapısal yeniden düzenlenmesini kolaylaştırmak ve DNA tamir 6 katkıda bulunduğuna inanılmaktadır. Tamir doğrudan katılım da ötesinde, ilave rollerin, bir intra-S kapısı, bir G2 / M kontrol noktası, düzenleyici ve aşağı doğru DDR proteinleri 7-9 aktive olduğu gibi, DDR de 53BP1 için tarif edilmiştir. Son zamanlarda, 53BP1 yerine DSBs 6 civarına lokalize önce G1 girmek hücreleri bekliyor, mitoz sırasında indüklenen DNA hasarına yanıt olarak odaklar teşkil etmemektedir keşfedilmiştir. Bu tür 53BP1 gibi DDR proteinleri mitoz ile 10 arasındaki ilerlemesi esnasında mitotik yapılar (kinetochores gibi) ile ilişkilendirmek için tespit edilmiştir. Bu protokolü biz 2 kullanılmasını tanımlamak - ve 3-D canlı hücre görüntüleme görselleştirmek içinDNA hasarına neden olan ajan kamptotesin (CPT) yanı sıra, mitoz sırasında 53BP1 davranışı yanıt olarak 53BP1 odaklarının oluşumu. Kamptotesin öncelikle DNA replikasyonu sırasında DSBs neden ben inhibitörü bir topoizomeraz olduğunu. Bunu başarmak için, biz daha önce açıklanan 53BP1-mCherry floresan füzyon proteini DSBs 11 bağlamak mümkün bir 53BP1 proteinin etki oluşan inşa kullanılır. Buna ek olarak, bir histon H2B-GFP füzyon proteini floresan mitoz sırasında 12 hücre döngüsü boyunca ama özellikle kromatin dinamik izlemek mümkün yapı kullanılır. Birden fazla boyutta canlı hücre görüntüleme ökaryotik hücrelerde DDR proteinlerin fonksiyonu anlayışımızı derinleştirmek için mükemmel bir araçtır.

Watch this Scientific Journal Video about Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins at JoVE.com

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Bu protokol, DNA hasarının yanı sıra, mitoz sırasında lokalizasyonu cevap olarak aktive bir çift iplikli DNA mola sinyal protein görüntülenmesi için bir yöntem açıklanır.

DNA Hasarı Tepki Proteinler İki ve Üç Boyutlu Canlı Hücre Görüntüleme

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Üç boyutlu Hücre ekimi için Chip-ölçekli Yapı iskeleleri mikroimalat

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

İki foton axotomy ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme canlı zebrafish embriyolar

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Görüntüleme Uyuşmazlığı DNA Hasar Onarım ve Hücresel Yanıtları Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Canlı Hücre Görüntüleme için SNAP-tag Fusion Proteinler ifade COS-7 Floresan Etiketleme

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Canlı Zebra balığı Embriyolar iki-Foton-Tabanlı fotoaktivasyon

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

GFP etiketli Proteinlerin Görüntüleme Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Oosit

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Için Fare Fetal Tüm Bağırsak Kültür Sistemi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sinyal facebook ve villus Kalkınma Üç boyutlu Canlı Görüntüleme Manipülasyon

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Üç boyutlu Hidrojeller içinde Görüntüleme FRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-Clear: Bir doku Yöntem yağ dokusu üç boyutlu görüntüleme için temizlenmesi

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...