Name: iterative optimization of dna duplexes for crystallization of seqa-dna complexes
Uploaded: 2012-11-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes at JoVE.com

الكتاب أود أن أشكر موظفي PXRR في NSLS (بروكهافن المختبر الوطني) للحصول على المساعدة خلال جمع البيانات ومونيكا بيلون للمساعدة في تنقية DNA. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (MOP 67189).

1. البروتين تنقية رابط مرنة تربط. N-(oligomerization) ومحطة C-(DNA ملزم) مجالات المساعدات SeqA الاعتراف يكرر GATC hemimethylated فصل تلو الآخر لثلاث لفات على DNA لهذه الدراسة، كنا البديل مثنوي من SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) مع طفرة نقطة في المجال N-محطة يمنع oligomerization وكذ...

<ol>
	<li>Campbell, J. L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+oriC+and+the+dnaA+gene+promoter+are+sequestered+from+dam+methyltransferase+following+the+passage+of+the+chromosomal+replication+fork.">E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork.</a> Cell. 62, 967-979 (1990).</li><li>Guarn&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+SeqA-N+filament:+implications+for+DNA+replication+and+chromosome+organization.">Crystal structure of a SeqA-N filament: implications for DNA replication and chromosome organization.</a> Embo. J. 24, 1502-1511 (2005).</li><li>Brendler, T., Austin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+SeqA+protein+to+DNA+requires+interaction+between+two+or+more+complexes+bound+to+separate+hemimethylated+GATC+sequences.">Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences.</a> Embo. J. 18, 2304-2310 (1999).</li><li>Jordan, S. R., Whitcombe, T. V., Berg, J. M., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+variation+in+DNA+length+yields+highly+ordered+repressor-operator+cocrystals.">Systematic variation in DNA length yields highly ordered repressor-operator cocrystals.</a> Science. 230, 1383-1385 (1985).</li><li>Tan, S., Hunziker, Y., Pellegrini, L., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+the+yeast+MATalpha2/MCM1/DNA+ternary+complex:+general+methods+and+principles+for+protein/DNA+cocrystallization.">Crystallization of the yeast MATalpha2/MCM1/DNA ternary complex: general methods and principles for protein/DNA cocrystallization.</a> J. Mol. Biol. 297, 947-959 (2000).</li><li>Rice, P. A., Yang, S., Mizuuchi, K., Nash, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+IHF-DNA+complex:+a+protein-induced+DNA+U-turn.">Crystal structure of an IHF-DNA complex: a protein-induced DNA U-turn.</a> Cell. 87, 1295-1306 (1996).</li><li>Yang, W., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+site-specific+recombinase+gamma+delta+resolvase+complexed+with+a+34+bp+cleavage+site.">Crystal structure of the site-specific recombinase gamma delta resolvase complexed with a 34 bp cleavage site.</a> Cell. 82, 193-207 (1995).</li><li>Chung, Y. S., Brendler, T., Austin, S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+cooperative+binding+of+SeqA+to+a+tandem+GATC+repeat.">Structural insights into the cooperative binding of SeqA to a tandem GATC repeat.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li><li>Anderson, J., Ptashne, M., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocrystals+of+the+DNA-binding+domain+of+phage+434+repressor+and+a+synthetic+phage+434+operator.">Cocrystals of the DNA-binding domain of phage 434 repressor and a synthetic phage 434 operator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1307-1311 (1984).</li><li>Timsit, Y., Moras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+self-fitting:+the+double+helix+directs+the+geometry+of+its+supramolecular+assembly.">DNA self-fitting: the double helix directs the geometry of its supramolecular assembly.</a> Embo J. 13, 2737-2746 (1994).</li><li>Chung, Y. S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+SeqA+bound+to+a+pair+of+hemimethylated+GATC+sites.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of SeqA bound to a pair of hemimethylated GATC sites.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 64, 567-571 (2008).</li><li>DeLano, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphic Systems. , (2002).</li></ol>

واحدة من أكبر التحديات في البلورات بالأشعة السينية الجزيئات هو الحصول على بلورات نوعية حيود. في حالة المجمعات البروتين أو البروتين DNA، ويتفاقم هذا التحدي بسبب المتغيرات الإضافية التي يجب أن يكون الأمثل. ويعتقد على نطاق واسع أن طول DNA وجود يتدلى زجة لتعزيز رابطة الجوا...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج # </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> TRIS </td><td> Bioshop </td><td> TRS003.5 </td><td></td></tr><tr><td> Ethylenediaminetetraacetic حمض (EDTA) </td><td> فيشر العلمية </td><td> E478-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiotheitrol (DTT) </td><td> الحيوية الأساسية شركة </td><td> DB0058 </td><td></td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> Bioshop </td><td> SOD002.10 </td><td></td></tr><tr><td> الغليسيرول </td><td> كاليدون </td><td> 5350-1 </td><td></td></tr><tr><td> سكر القصب </td><td> سيغما الدريخ </td><td> S5016-500G </td><td></td></tr><tr><td> كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) </td><td> Bioshop </td><td> SDS001.500 </td><td></td></tr><tr><td> اليوريا </td><td> Bioshop </td><td> URE001.5 </td><td></td></tr><tr><td> 29:1٪ 40 مكررا / الأكريلاميد </td><td> الحيوية الأساسية شركة </td><td> A0007-500ml </td><td> تخزين عند 4 ° C </td></tr><tr><td> حمض البوريك </td><td> EMD </td><td> BX0865-1 </td><td></td></tr><tr><td> الزيلين cyanol FF </td><td> بيو راد </td><td> 161-0423 </td><td></td></tr><tr><td> زرقة البروموفينول </td><td> Bioshop </td><td> BR0222 </td><td></td></tr><tr><td> تعديل النظام المزدوج جل العمودي </td><td> CBC الشركة العلمية شركة </td><td> DASG-250 </td><td></td></tr><tr><td> مؤشر بلورة الشاشة </td><td> البحث هامبتون </td><td> HR2-144 </td><td> تخزين عند 4 ° C </td></tr><tr><td> معالج شاشة I تبلور </td><td> الزمرد النظم البيولوجية </td><td> EBS-WIZ-1 </td><td> تخزين عند 4 ° C </td></tr><tr><td> معالج شاشة بلورة II </td><td&gt; الزمرد النظم البيولوجية </td><td> EBS-WIZ-2 </td><td> تخزين عند 4 ° C </td></tr><tr><td> كلاسيكيات بلورة الشاشة </td><td> QIAGEN </td><td> 130701 </td><td> تخزين عند 4 ° C </td></tr><tr><td> الصواني Intelliplate </td><td> الفن روبنز الصكوك </td><td> 102-0001-00 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> حلول البروتين العازلة تنقية: 100 ملي تريس الرقم الهيدروجيني 8، 2 مم EDTA، 2 DTT ملم والجلسرين 5٪. البروتين المخزن المؤقت التخزين: 20 ملي تريس الرقم الهيدروجيني 8، 150 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي DTT، 0.5 مم EDTA والجلسرين 5٪. هلام مزيج التحميل: إضافة 20 غراما من السكروز، 25 ملغ من اللون الأزرق bromophenol، 25 ملغ من FF cyanol الزيلين، 1 مل من 10٪ وزن / حجم SDS و 10 مل من TBE 10X إلى 70 مل من 2 تعقيمها O. DDH اثارة مع التدفئة خفيفة حتى يذوب السكروز وضبط النهائيحجم 100 مل لتعقيمها مع 2 O. DDH تخزين في C. ° 4 2X العازلة التحميل: إضافة 11 غرام من اليوريا إلى 10 مل من مزيج هلام التحميل. يحرك المزيج على لوحة الساخن حتى يذوب اليوريا. قسامة في أنابيب 2 مل وتخزينها في 4 درجات مئوية. 10X مزيج PAGE: مزيج 420،4 غرام من اليوريا، و 100 مل من TBE 10X (تعقيمها)، 250 مل من 40٪ 29:1 مكرر / الأكريلاميد في DDH 2 O. يحرك حتى يذوب تماما وضبط مستوى الصوت إلى 1 لتر. تخزين في زجاجات داكنة في C. ° 4 10X TBE: حل 108 ز من TRIS، 55 غرام من حمض البوريك و 9.3 غرام من EDTA في 1 لتر من DDH 2 O. الأوتوكلاف وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. شطف العازلة: 8 مل من المخفف كلوريد الصوديوم M 5، 2 مل من 1 M الرقم الهيدروجيني 7،5 TRIS، 0.4 مل من 0.5 درجة الحموضة EDTA M 8 على 200 مل من DDH 2 O. الأوتوكلاف وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. </td></tr></tbody></tabجنيه&gt;

iterative optimization of dna duplexes for crystallization of seqa-dna complexes

القولونية الإشريكية SeqA هو المنظم السلبية لتكرار الحمض النووي الذي يمنع المبكرة من الأحداث باستعادة مجموعات عزل GATC hemimethylated في الأصل من النسخ المتماثل 1. ما وراء الأصل، تم العثور على الشوك SeqA النسخ المتماثل، حيث تنظم DNA تكرارها حديثا في الهياكل العليا أمرت 2. SeqA الزميلة ضعيفة فقط مع تسلسل GATC واحدة، ولكنها تشكل مجمعات تقارب عالية مع الدوبلكس DNA التي تحتوي على مواقع متعددة GATC. الحد الأدنى من وحدة وظيفية وهيكلية من SeqA هو ديمر، موضحا بذلك الشرط ما لا يقل عن اثنين من سلاسل GATC لتشكيل مجمع عالية تقارب مع DNA hemimethylated 3. بالإضافة إلى ذلك، فإن هيكل SeqA، مع oligomerization وDNA ملزم المجالات مفصولة رابط مرنة، تسمح ملزمة ليكرر GATC مفصولة حتى يتحول حلزونية الثلاثة. لذلك، فهم وظيفة SeqA على المستوى الجزيئي يتطلب آنا الهيكليةتحلل من SeqA بد أن تسلسل GATC متعددة. في البروتين DNA التبلور، يمكن DNA لا شيء لتأثير استثنائي على التفاعلات التعبئة اعتمادا على الأحجام النسبية والهندسة المعمارية من البروتين والحمض النووي لل. إذا كان البروتين أكبر من DNA أو آثار أقدام معظم DNA، وتوسط في المقام الأول على التعبئة من الكريستال البروتين البروتين التفاعلات. وعلى العكس، عندما البروتين هو نفس الحجم أو أصغر من DNA أو أنه لا يغطي سوى جزء بسيط من التفاعلات DNA، والحمض النووي DNA-DNA والبروتين تهيمن التعبئة وضوح الشمس. ولذلك، بلورة البروتين DNA المجمعات يتطلب الفحص المنتظم من 4 طول DNA وينتهي DNA (كليلة أو عبء) 5-7. في هذا التقرير، ونحن تصف كيفية تصميم وتحسين وتنقية وبلورة دوبلكسات DNA hemimethylated تحتوي على جنبا إلى جنب يكرر GATC في مجمع مع متغير من مثنوي SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) للحصول على بلورات مناسبة لتحديد الهيكل.

Watch this Scientific Journal Video about Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes at JoVE.com

Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

يمكن التركيب البلوري للبروتين DNA-المجمعات توفير نظرة ثاقبة وظيفة البروتين، وآلية، وكذلك، فإن طبيعة التفاعل محددة. هنا، ونحن التقرير كيفية تحسين طول، وينتهي تسلسل الحمض النووي دوبلكس للتبلور بالتعاون مع<em&gt; كولاي</em&gt; SeqA، منظم السلبية للبدء النسخ المتماثل.

تكرارية الأمثل من دوبلكسات DNA لبلورة-DNA من SeqA مجمعات

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

Research

JoVE Journal

Biology

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

البلورة البروتين لالبلورات بالأشعة السينية

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

بلورة البروتينات في الغشاء Mesophases Lipidic

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

الإنتاجية العالية للبروتينات غشاء البلورة باستخدام أسلوب Bicelle Lipidic

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

استخدام روبوت لارتفاع الإنتاجية البلورة من بروتينات الغشاء في Mesophases شحمي

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

الأمثل والاستفادة من<em&gt; الأجرعية</em&gt; بوساطة إنتاج بروتين عابر في<em&gt; نيكوتيانا</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

رسم الخرائط على أساس فؤاد للخصائص مطاطا جدران الخلايا: في الأنسجة، الخلوية، وقرارات التحت خلوية

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

التصوير في الوقت الحقيقي من واحدة المهندسة رنا النصوص في الخلايا الحية عن طريق Ratiometric ثنائي الجزيء منارات

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

جيل وتنقية الإنسان INO80 ونين إعادة عرض مجمعات وSubcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

كفاءة الثدييات التعبير خلية وخطوة واحدة خارج الخلية تنقية البروتينات السكرية لبلورة

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Electroporation لل، عزل والتصوير من Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...