Name: iterative optimization of dna duplexes for crystallization of seqa-dna complexes
Uploaded: 2012-11-01T15:00:00
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Les auteurs tiennent à remercier le personnel PXRR au NSLS (Brookhaven National Laboratory) pour l&#39;assistance au cours de la collecte des données et Monica Pillon de l&#39;aide pour la purification d&#39;ADN. Ce travail a été soutenu par les Instituts de recherche en santé (MOP 67189).

1. Purification des protéines La séquence de liaison flexible reliant l&#39;. N-(oligomérisation) et C-terminal (liaison à l&#39;ADN) domaines de SEQA aides à la reconnaissance des répétitions hémiméthylé GATC séparées par une à trois spires de l&#39;ADN Pour cette étude, nous avons utilisé une variante de dimère de SEQA (SeqAΔ (41-59)-A25R) avec une mutation ponctuelle dans le domaine N-terminal qui empêche davantage d&#39;oligomérisation et un lieur raccourci qui limite li...

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	<li>Campbell, J. L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+oriC+and+the+dnaA+gene+promoter+are+sequestered+from+dam+methyltransferase+following+the+passage+of+the+chromosomal+replication+fork.">E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork.</a> Cell. 62, 967-979 (1990).</li><li>Guarn&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+SeqA-N+filament:+implications+for+DNA+replication+and+chromosome+organization.">Crystal structure of a SeqA-N filament: implications for DNA replication and chromosome organization.</a> Embo. J. 24, 1502-1511 (2005).</li><li>Brendler, T., Austin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+SeqA+protein+to+DNA+requires+interaction+between+two+or+more+complexes+bound+to+separate+hemimethylated+GATC+sequences.">Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences.</a> Embo. J. 18, 2304-2310 (1999).</li><li>Jordan, S. R., Whitcombe, T. V., Berg, J. M., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+variation+in+DNA+length+yields+highly+ordered+repressor-operator+cocrystals.">Systematic variation in DNA length yields highly ordered repressor-operator cocrystals.</a> Science. 230, 1383-1385 (1985).</li><li>Tan, S., Hunziker, Y., Pellegrini, L., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+the+yeast+MATalpha2/MCM1/DNA+ternary+complex:+general+methods+and+principles+for+protein/DNA+cocrystallization.">Crystallization of the yeast MATalpha2/MCM1/DNA ternary complex: general methods and principles for protein/DNA cocrystallization.</a> J. Mol. Biol. 297, 947-959 (2000).</li><li>Rice, P. A., Yang, S., Mizuuchi, K., Nash, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+IHF-DNA+complex:+a+protein-induced+DNA+U-turn.">Crystal structure of an IHF-DNA complex: a protein-induced DNA U-turn.</a> Cell. 87, 1295-1306 (1996).</li><li>Yang, W., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+site-specific+recombinase+gamma+delta+resolvase+complexed+with+a+34+bp+cleavage+site.">Crystal structure of the site-specific recombinase gamma delta resolvase complexed with a 34 bp cleavage site.</a> Cell. 82, 193-207 (1995).</li><li>Chung, Y. S., Brendler, T., Austin, S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+cooperative+binding+of+SeqA+to+a+tandem+GATC+repeat.">Structural insights into the cooperative binding of SeqA to a tandem GATC repeat.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li><li>Anderson, J., Ptashne, M., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocrystals+of+the+DNA-binding+domain+of+phage+434+repressor+and+a+synthetic+phage+434+operator.">Cocrystals of the DNA-binding domain of phage 434 repressor and a synthetic phage 434 operator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1307-1311 (1984).</li><li>Timsit, Y., Moras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+self-fitting:+the+double+helix+directs+the+geometry+of+its+supramolecular+assembly.">DNA self-fitting: the double helix directs the geometry of its supramolecular assembly.</a> Embo J. 13, 2737-2746 (1994).</li><li>Chung, Y. S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+SeqA+bound+to+a+pair+of+hemimethylated+GATC+sites.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of SeqA bound to a pair of hemimethylated GATC sites.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 64, 567-571 (2008).</li><li>DeLano, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphic Systems. , (2002).</li></ol>

Un des plus grands défis dans macromoléculaire cristallographie aux rayons X est d&#39;obtenir des cristaux de qualité de diffraction. Dans le cas des complexes de protéines ou de protéines-ADN, ce défi est exacerbée en raison des variables supplémentaires qui doivent être optimisés. Il est largement admis que la longueur de l&#39;ADN et la présence de surplombs collantes pour renforcer l&#39;association de molécules d&#39;ADN voisines dans un pseudo-duplex plus sont les principaux paramètres à optimiser. ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Catalogue # </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> TRIS </td><td> Bioshop </td><td> TRS003.5 </td><td></td></tr><tr><td> Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) </td><td> Fisher Scientific </td><td> E478-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiotheitrol (TNT) </td><td> Bio Basic Inc </td><td> DB0058 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Bioshop </td><td> SOD002.10 </td><td></td></tr><tr><td> Glycérol </td><td> Caledon </td><td> 5350-1 </td><td></td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5016-500G </td><td></td></tr><tr><td> Dodécyl sulfate de sodium (SDS) </td><td> Bioshop </td><td> SDS001.500 </td><td></td></tr><tr><td> Urée </td><td> Bioshop </td><td> URE001.5 </td><td></td></tr><tr><td> 40% Bis 29:1 / acrylamide </td><td> Bio Basic Inc </td><td> A0007-500ml </td><td> Stocker à 4 ° C </td></tr><tr><td> L&#39;acide borique </td><td> EMD </td><td> BX0865-1 </td><td></td></tr><tr><td> Xylène cyanol FF </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0423 </td><td></td></tr><tr><td> Bleu de bromophénol </td><td> Bioshop </td><td> BR0222 </td><td></td></tr><tr><td> Système double réglable Gel verticale </td><td> CBC Scientific Company Inc </td><td> SGAD-250 </td><td></td></tr><tr><td> Indice de cristallisation écran </td><td> Hampton Research </td><td> HR2-144 </td><td> Stocker à 4 ° C </td></tr><tr><td> Écran de l&#39;assistant cristallisation je </td><td> Emerald BioSystems </td><td> EBS-WIZ-1 </td><td> Stocker à 4 ° C </td></tr><tr><td> Écran de l&#39;assistant cristallisation II </td><td&gt; Emerald BioSystems </td><td> EBS-WIZ-2 </td><td> Stocker à 4 ° C </td></tr><tr><td> Écran cristallisation Classics </td><td> Qiagen </td><td> 130701 </td><td> Stocker à 4 ° C </td></tr><tr><td> Plateaux Intelliplate </td><td> Art Robbins Instruments </td><td> 102-0001-00 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Solutions Tampon de purification de protéines: 100 mM Tris pH 8, EDTA 2 mM, DTT 2 mM et glycérol 5%. Tampon de stockage Protéines: 20 mM Tris pH 8, NaCl 150 mM, DTT 5 mM, EDTA 0,5 mM et glycérol à 5%. Mélange chargement de gel: Ajouter 20 g de saccharose, 25 mg de bleu de bromophénol, 25 mg de xylène cyanol FF, 1 ml de 10% p / v de SDS et 10 ml de TBE 10X à 70 ml d&#39;autoclave ddH O. 2 Remuer avec un chauffage doux jusqu&#39;à ce que le saccharose est dissous et ajuster la finalevolume à 100 ml avec de l&#39;autoclave ddH O. 2 Stocker à 4 ° C. Tampon de charge 2X: Ajouter 11 g d&#39;urée à 10 ml de mélange de chargement de gel. Incorporer sur une plaque chauffante jusqu&#39;à ce que l&#39;urée se dissout. Aliquoter en tubes de 2 ml et conserver à 4 ° C. PAGE 10X mélange: Mélanger 420,4 g d&#39;urée, 100 ml de TBE 10X (autoclave), 250 ml de 40% 29:1 Bis / acrylamide dans les ddH 2 O. Remuer jusqu&#39;à ce que complètement dissous et ajuster le volume à 1 litre. Stocker dans des bouteilles foncées à 4 ° C. TBE 10X: Dissoudre 108 g de TRIS, 55 g d&#39;acide borique et 9,3 g d&#39;EDTA à 1 litre de ddH 2 O. Autoclave et conserver à température ambiante. Tampon d&#39;élution: Diluer 8 ml de NaCl 5 M, 2 ml de 1 M pH TRIS 7,5, 0,4 ml d&#39;EDTA 0,5 M pH 8 sur 200 ml de ddH 2 O. Autoclave et conserver à température ambiante. </td></tr></tbody></table&gt;

iterative optimization of dna duplexes for crystallization of seqa-dna complexes

Escherichia coli SEQA est un régulateur négatif de la réplication de l&#39;ADN qui empêche prématurés événements réinitiation par séquestrants hémiméthylé grappes GATC au sein de l&#39;origine de réplication 1. Au-delà de l&#39;origine, SEQA se trouve à la fourche de réplication, où il organise l&#39;ADN nouvellement répliqué par une augmentation des structures ordonnées 2. SEQA que faiblement associés avec des séquences GATC simples, mais il forme des complexes de haute affinité avec les duplexes d&#39;ADN contenant plusieurs sites GATC. L&#39;unité minimale fonctionnelle et structurelle de SEQA est un dimère, ce qui explique l&#39;exigence d&#39;au moins deux séquences GATC pour former un complexe de haute affinité avec l&#39;ADN hémiméthylé 3. En outre, l&#39;architecture SEQA, avec l&#39;oligomérisation et de liaison d&#39;ADN domaines séparés par un lieur flexible, permet la liaison de répétitions GATC séparés par jusqu&#39;à trois spires hélicoïdales. Par conséquent, la compréhension de la fonction de SEQA au niveau moléculaire nécessite la structure analyse des SEQA lié à de multiples séquences GATC. En protéine-ADN cristallisation, l&#39;ADN peut n&#39;en ai pas à un effet exceptionnel sur les interactions d&#39;emballage en fonction de la taille relative et l&#39;architecture de la protéine et l&#39;ADN. Si la protéine est plus grande que la plupart des empreintes d&#39;ADN ou de l&#39;ADN, l&#39;empilement cristallin est principalement médié par interactions protéine-protéine. A l&#39;inverse, lorsque la protéine est de la même taille ou plus petite que l&#39;ADN ou ne couvre qu&#39;une fraction de l&#39;interaction ADN, ADN-ADN et l&#39;ADN-protéine dominer empilement cristallin. Par conséquent, la cristallisation de complexes protéine-ADN nécessite le dépistage systématique de longueur 4 de l&#39;ADN et l&#39;ADN (extrémités émoussées ou faux) 5-7. Dans ce rapport, nous décrivons comment concevoir, optimiser, de purifier et cristalliser duplex d&#39;ADN contenant des répétitions en tandem hémiméthylé GATC dans un complexe avec une variante dimère de SEQA (SeqAΔ (41-59)-A25R) pour obtenir des cristaux appropriés pour déterminer la structure.

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Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

Structure cristalline des complexes protéine-ADN peuvent donner une idée fonction de la protéine, mécanisme, ainsi que la nature de l&#39;interaction spécifique. Nous rapportons ici comment optimiser la durée, la séquence et extrémités de l&#39;ADN double brin pour la co-cristallisation avec<em&gt; Escherichia coli</em&gt; SEQA, un régulateur négatif de l&#39;initiation de la réplication.

Itératif d&#39;optimisation des duplex d&#39;ADN pour la cristallisation des complexes ADN-SEQA

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

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