Name: iterative optimization of dna duplexes for crystallization of seqa-dna complexes
Uploaded: 2012-11-01T15:00:00
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Die Autoren möchten die PXRR Mitarbeiter an der NSLS (Brookhaven National Laboratory) danken für die Unterstützung während der Datensammlung und Monica Pillon für die Hilfe bei DNA-Aufreinigung. Diese Arbeit wurde von der kanadischen Institutes of Health Research (MOP 67.189) unterstützt.

Ein. Protein Purification Der flexible Linker, das N-(Oligomerisierung) und C-terminalen (DNA Bindung) Domänen von SeqA Hilfsmittel die Erkennung hemimethylierte GATC Repeats durch ein bis drei Windungen auf der DNA getrennt. Für diese Studie verwendeten wir eine dimere Variante SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) mit einer Punktmutation in der N-terminalen Domäne, die weitere Oligomerisierung und eine verkürzte DNA Linkers, der die Bindung an GATC Tandem wiederholt ausschließlich durch abgetrennt...

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	<li>Campbell, J. L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+oriC+and+the+dnaA+gene+promoter+are+sequestered+from+dam+methyltransferase+following+the+passage+of+the+chromosomal+replication+fork.">E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork.</a> Cell. 62, 967-979 (1990).</li><li>Guarn&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+SeqA-N+filament:+implications+for+DNA+replication+and+chromosome+organization.">Crystal structure of a SeqA-N filament: implications for DNA replication and chromosome organization.</a> Embo. J. 24, 1502-1511 (2005).</li><li>Brendler, T., Austin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+SeqA+protein+to+DNA+requires+interaction+between+two+or+more+complexes+bound+to+separate+hemimethylated+GATC+sequences.">Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences.</a> Embo. J. 18, 2304-2310 (1999).</li><li>Jordan, S. R., Whitcombe, T. V., Berg, J. M., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+variation+in+DNA+length+yields+highly+ordered+repressor-operator+cocrystals.">Systematic variation in DNA length yields highly ordered repressor-operator cocrystals.</a> Science. 230, 1383-1385 (1985).</li><li>Tan, S., Hunziker, Y., Pellegrini, L., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+the+yeast+MATalpha2/MCM1/DNA+ternary+complex:+general+methods+and+principles+for+protein/DNA+cocrystallization.">Crystallization of the yeast MATalpha2/MCM1/DNA ternary complex: general methods and principles for protein/DNA cocrystallization.</a> J. Mol. Biol. 297, 947-959 (2000).</li><li>Rice, P. A., Yang, S., Mizuuchi, K., Nash, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+IHF-DNA+complex:+a+protein-induced+DNA+U-turn.">Crystal structure of an IHF-DNA complex: a protein-induced DNA U-turn.</a> Cell. 87, 1295-1306 (1996).</li><li>Yang, W., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+site-specific+recombinase+gamma+delta+resolvase+complexed+with+a+34+bp+cleavage+site.">Crystal structure of the site-specific recombinase gamma delta resolvase complexed with a 34 bp cleavage site.</a> Cell. 82, 193-207 (1995).</li><li>Chung, Y. S., Brendler, T., Austin, S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+cooperative+binding+of+SeqA+to+a+tandem+GATC+repeat.">Structural insights into the cooperative binding of SeqA to a tandem GATC repeat.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li><li>Anderson, J., Ptashne, M., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocrystals+of+the+DNA-binding+domain+of+phage+434+repressor+and+a+synthetic+phage+434+operator.">Cocrystals of the DNA-binding domain of phage 434 repressor and a synthetic phage 434 operator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1307-1311 (1984).</li><li>Timsit, Y., Moras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+self-fitting:+the+double+helix+directs+the+geometry+of+its+supramolecular+assembly.">DNA self-fitting: the double helix directs the geometry of its supramolecular assembly.</a> Embo J. 13, 2737-2746 (1994).</li><li>Chung, Y. S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+SeqA+bound+to+a+pair+of+hemimethylated+GATC+sites.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of SeqA bound to a pair of hemimethylated GATC sites.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 64, 567-571 (2008).</li><li>DeLano, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphic Systems. , (2002).</li></ol>

Eine der größten Herausforderungen in der makromolekularen Röntgenkristallographie ist der Erhalt Beugungsqualität Kristalle. Im Falle von Protein-oder Protein-DNA-Komplexe, wird diese Herausforderung verschärft durch die zusätzlichen Variablen optimiert werden müssen. Es wird allgemein angenommen, dass die Länge der DNA und die Anwesenheit von klebrigen Überhänge zur Vereinigung von benachbarten DNA-Moleküle in einer längeren Pseudo-Duplex werden die wesentlichen Parameter zur Optimierung verbessern. Wir ha...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog # </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> TRIS </td><td> Bioshop </td><td> TRS003.5 </td><td></td></tr><tr><td> Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) </td><td> Fisher Scientific </td><td> E478-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiotheitrol (DTT) </td><td> Bio Grundlegende Inc. </td><td> DB0058 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Bioshop </td><td> SOD002.10 </td><td></td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Caledon </td><td> 5350-1 </td><td></td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5016-500G </td><td></td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfat (SDS) </td><td> Bioshop </td><td> SDS001.500 </td><td></td></tr><tr><td> Harnstoff </td><td> Bioshop </td><td> URE001.5 </td><td></td></tr><tr><td> 40% 29:1 Bis / Acrylamid </td><td> Bio Grundlegende Inc. </td><td> A0007-500ml </td><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr><tr><td> Borsäure </td><td> EMD </td><td> BX0865-1 </td><td></td></tr><tr><td> Xylencyanol FF </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0423 </td><td></td></tr><tr><td> Bromphenolblau </td><td> Bioshop </td><td> BR0222 </td><td></td></tr><tr><td> Dual Adjustable Vertical Gel System </td><td> CBC Scientific Company Inc. </td><td> DASG-250 </td><td></td></tr><tr><td> Index Kristallisation Bildschirm </td><td> Hampton Research </td><td> HR2-144 </td><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr><tr><td> Wizard I Kristallisation Bildschirm </td><td> Smaragd BioSystems </td><td> EBS-WIZ-1 </td><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr><tr><td> Wizard II Kristallisation Bildschirm </td><td&gt; Emerald BioSystems </td><td> EBS-WIZ-2 </td><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr><tr><td> Classics Kristallisation Bildschirm </td><td> Qiagen </td><td> 130701 </td><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr><tr><td> Intelliplate Trays </td><td> Art Robbins Instruments </td><td> 102-0001-00 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Lösungen Proteinreinigung Puffer: 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT und 5% Glycerin. Protein Lagerungspuffer: 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0,5 mM EDTA und 5% Glycerin. Gelbeladung Mix: 20 g Saccharose, 25 mg Bromphenolblau, 25 mg Xylencyanol FF, 1 ml von 10% w / v SDS und 10 ml 10X TBE bis 70 ml autoklaviertem ddH 2 O. Rühren Sie mit leichtem Erwärmen bis Saccharose aufgelöst und stellen die endgültigeVolumen auf 100 ml mit autoklaviertem ddH 2 O. Lagerung bei 4 ° C. 2X Ladepuffer: In 11 g Harnstoff in 10 ml Gelbeladung Mix. Stir auf einer Heizplatte bis Harnstoff auflöst. Aliquot in 2 ml Röhrchen und bei 4 ° C. 10X PAGE-Mix: Mix 420,4 g Harnstoff, 100 ml 10X TBE (autoklaviert), 250 ml von 40% 29:1 Bis / Acrylamid in ddH 2 O. Rühren, bis vollständig gelöst und die Lautstärke auf 1 Liter. Bewahren Sie in dunklen Flaschen bei 4 ° C. 10X TBE: auflösen 108 g TRIS, 55 g Borsäure und 9,3 g EDTA in 1 Liter ddH 2 O. Autoklaven und bei Raumtemperatur lagern. Elutionspuffer: Verdünnen 8 ml 5 M NaCl, 2 ml 1 M Tris pH 7,5, 0,4 ml 0,5 M EDTA pH 8 auf 200 ml ddH 2 O. Autoklaven und bei Raumtemperatur lagern. </td></tr></tbody></table&gt;

iterative optimization of dna duplexes for crystallization of seqa-dna complexes

Escherichia coli SeqA ist ein negativer Regulator der DNA-Replikation, die vorzeitige Reinitiation Ereignisse durch Maskierungsmittel hemimethylierte GATC Cluster verhindert innerhalb der Replikationsursprung ein. Jenseits der Herkunft, wird SeqA an den Replikationsgabeln, wo es neu replizierte DNA organisiert in höhere geordneten Strukturen 2 gefunden. SeqA Mitarbeiter nur schwach mit einzelnen GATC-Sequenzen, aber es bildet eine hohe Affinität Komplexe mit DNA-Duplexe mit mehreren GATC Seiten. Die minimale funktionelle und strukturelle Einheit SeqA ein Dimer, wodurch Erläuterung der Anforderung von wenigstens zwei GATC-Sequenzen, um eine hohe Affinität Komplex mit DNA hemimethylierte 3 zu bilden. Zusätzlich erlaubt die SeqA Architektur, mit der Oligomerisierung und DNA-bindenden Domänen durch einen flexiblen Linker getrennt sind, die Bindung an GATC Repeats durch bis zu drei Wendelgänge getrennt. Daher Verständnis der Funktion SeqA auf molekularer Ebene erfordert die strukturelle anaLyse SeqA mehrere GATC Sequenzen gebunden. In Protein-DNA Kristallisation kann DNA keine haben eine außergewöhnliche Wirkung auf die Verpackung Wechselwirkungen in Abhängigkeit von den relativen Größen und Architektur des Proteins und der DNA. Wenn das Protein größer ist als die DNA oder Fußabdrücke meisten der DNA wird die Kristallpackung primär durch Protein-Protein-Wechselwirkungen vermittelt. Umgekehrt, wenn das Protein die gleiche Größe oder kleiner als der DNA ist, oder es deckt nur einen Teil der DNA-, DNA-DNA-und DNA-Protein-Wechselwirkungen Kristallpackung dominieren. Daher erfordert Kristallisation von Protein-DNA-Komplexe die systematische Screening von DNA-Länge 4 und DNA-Enden (blunt oder Überhang) 5-7. In diesem Bericht beschreiben wir, wie zu entwerfen, zu optimieren, zu reinigen und zu kristallisieren hemimethylierte DNA-Duplexe mit Tandem-GATC Wiederholungen im Komplex mit einem dimeren Variante SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R), um geeignete Kristalle für die Strukturaufklärung erhalten.

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Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

Kristallstruktur von Protein-DNA-Komplexe können Einblick in Proteinfunktion, Mechanismus, sowie, die Natur der spezifischen Wechselwirkung bereitzustellen. Hier berichten wir, wie die Länge, Sequenz und Enden der DNA-Doppelstrang für Co-Kristallisation zu optimieren mit<em&gt; Escherichia coli</em&gt; SeqA, ein negativer Regulator der Replikation Initiation.

Iterative Optimierung der DNA-Duplexes für Kristallisation von SeqA-DNA-Komplexen

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

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