Name: iterative optimization of dna duplexes for crystallization of seqa-dna complexes
Uploaded: 2012-11-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות לצוות PXRR בNSLS (ברוקהייבן המעבדה הלאומית) לקבלת סיוע במהלך איסוף נתונים ומוניקה Pillon לעזרה בטיהור ה-DNA. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הקנדי לחקר בריאות (MOP 67189).

1. טיהור חלבון המקשר הגמיש חיבור N-(oligomerization) ו-C-מסוף (DNA המחייב) תחומי SeqA עזרי ההכרה חוזרת GATC hemimethylated המופרד 02:59 מדליק את ה-DNA. במחקר זה, שהייתי גרסה של dimeric SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) עם מוטציה נקודתית בתחום N-המסוף המונעת המשך oligomerization ומקשר קצר שמ?...

<ol>
	<li>Campbell, J. L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+oriC+and+the+dnaA+gene+promoter+are+sequestered+from+dam+methyltransferase+following+the+passage+of+the+chromosomal+replication+fork.">E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork.</a> Cell. 62, 967-979 (1990).</li><li>Guarn&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+SeqA-N+filament:+implications+for+DNA+replication+and+chromosome+organization.">Crystal structure of a SeqA-N filament: implications for DNA replication and chromosome organization.</a> Embo. J. 24, 1502-1511 (2005).</li><li>Brendler, T., Austin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+SeqA+protein+to+DNA+requires+interaction+between+two+or+more+complexes+bound+to+separate+hemimethylated+GATC+sequences.">Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences.</a> Embo. J. 18, 2304-2310 (1999).</li><li>Jordan, S. R., Whitcombe, T. V., Berg, J. M., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+variation+in+DNA+length+yields+highly+ordered+repressor-operator+cocrystals.">Systematic variation in DNA length yields highly ordered repressor-operator cocrystals.</a> Science. 230, 1383-1385 (1985).</li><li>Tan, S., Hunziker, Y., Pellegrini, L., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+the+yeast+MATalpha2/MCM1/DNA+ternary+complex:+general+methods+and+principles+for+protein/DNA+cocrystallization.">Crystallization of the yeast MATalpha2/MCM1/DNA ternary complex: general methods and principles for protein/DNA cocrystallization.</a> J. Mol. Biol. 297, 947-959 (2000).</li><li>Rice, P. A., Yang, S., Mizuuchi, K., Nash, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+IHF-DNA+complex:+a+protein-induced+DNA+U-turn.">Crystal structure of an IHF-DNA complex: a protein-induced DNA U-turn.</a> Cell. 87, 1295-1306 (1996).</li><li>Yang, W., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+site-specific+recombinase+gamma+delta+resolvase+complexed+with+a+34+bp+cleavage+site.">Crystal structure of the site-specific recombinase gamma delta resolvase complexed with a 34 bp cleavage site.</a> Cell. 82, 193-207 (1995).</li><li>Chung, Y. S., Brendler, T., Austin, S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+cooperative+binding+of+SeqA+to+a+tandem+GATC+repeat.">Structural insights into the cooperative binding of SeqA to a tandem GATC repeat.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li><li>Anderson, J., Ptashne, M., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocrystals+of+the+DNA-binding+domain+of+phage+434+repressor+and+a+synthetic+phage+434+operator.">Cocrystals of the DNA-binding domain of phage 434 repressor and a synthetic phage 434 operator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1307-1311 (1984).</li><li>Timsit, Y., Moras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+self-fitting:+the+double+helix+directs+the+geometry+of+its+supramolecular+assembly.">DNA self-fitting: the double helix directs the geometry of its supramolecular assembly.</a> Embo J. 13, 2737-2746 (1994).</li><li>Chung, Y. S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+SeqA+bound+to+a+pair+of+hemimethylated+GATC+sites.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of SeqA bound to a pair of hemimethylated GATC sites.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 64, 567-571 (2008).</li><li>DeLano, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphic Systems. , (2002).</li></ol>

אחד האתגרים הגדולים ביותר בקריסטלוגרפיה macromolecular רנטגן הוא קבלת גבישים באיכות עקיפה. במקרה של חלבון או חלבון-DNA תסביכים, אתגר זה מתעצם בשל משתנים הנוספים שצריך להיות מותאמים. הוא האמין נרחב כי אורכו של ה-DNA ואת הנוכחות של מסוכך דביק כדי לשפר את הקשר בין מולקולות דנ&quot;א ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> TRIS </td><td> Bioshop </td><td> TRS003.5 </td><td></td></tr><tr><td> Ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> E478-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiotheitrol (DTT) </td><td> יו היסוד בע&quot;מ </td><td> DB0058 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Bioshop </td><td> SOD002.10 </td><td></td></tr><tr><td> גליצרול </td><td> Caledon </td><td> 5350-1 </td><td></td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> S5016-500G </td><td></td></tr><tr><td> סולפט dodecyl נתרן (SDS) </td><td> Bioshop </td><td> SDS001.500 </td><td></td></tr><tr><td> אוריאה </td><td> Bioshop </td><td> URE001.5 </td><td></td></tr><tr><td> 40% Bis 29:1 / acrylamide </td><td> יו היסוד בע&quot;מ </td><td> A0007-500ml </td><td> לאחסן ב 4 ° C </td></tr><tr><td> חומצה בורה </td><td> EMD </td><td> BX0865-1 </td><td></td></tr><tr><td> קסילן cyanol FF </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0423 </td><td></td></tr><tr><td> בלו Bromophenol </td><td> Bioshop </td><td> BR0222 </td><td></td></tr><tr><td> מערכת ג&#39;ל כפולה מתכוונן אנכי </td><td> CBC המדעי חברה בע&quot;מ </td><td> DASG-250 </td><td></td></tr><tr><td> מסך התגבשות אינדקס </td><td> המפטון מחקר </td><td> HR2-144 </td><td> לאחסן ב 4 ° C </td></tr><tr><td> מסך התגבשות אני אשף </td><td> אמרלד BioSystems </td><td> EBS-Wiz-1 </td><td> לאחסן ב 4 ° C </td></tr><tr><td> מסך התגבשות השנייה אשף </td><td&gt; אמרלד BioSystems </td><td> EBS-Wiz-2 </td><td> לאחסן ב 4 ° C </td></tr><tr><td> קלאסיקות מסך התגבשות </td><td> Qiagen </td><td> 130701 </td><td> לאחסן ב 4 ° C </td></tr><tr><td> מגשי Intelliplate </td><td> אמנות רובינס מכשירים </td><td> 102-0001-00 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> פתרונות חיץ חלבון טיהור: 100 המ&quot;מימ TRIS pH 8, 2 המ&quot;מ EDTA, mM DTT 2 ו 5% גליצרול. חיץ חלבון אחסון: 20 המ&quot;מ TRIS pH 8, 150 המ&quot;מ NaCl, 5 המ&quot;מ DTT, 0.5 המ&quot;מ EDTA ו5% גליצרול. תמהיל ג&#39;ל טעינה: הוסף 20 גרם של סוכרוז, 25 מ&quot;ג של כחול bromophenol, 25 מ&quot;ג של cyanol FF קסילן, 1 מ&quot;ל של 10% w / v SDS ו10 מ&quot;ל של TBE 10X עד 70 מ&quot;ל של autoclaved DDH 2 O. מערבב עם חימום קל עד סוכרוז נמס ולהתאים הסופייםנפח עד 100 מ&quot;ל עם autoclaved DDH 2 O. לאחסן ב 4 ° C. חיץ הטעינה 2X: הוסף 11 גרם של אוריאה עד 10 מ&quot;ל של תערובת טעינת ג&#39;ל. מערבב בצלחת חמה עד האוריאה מתמוססת. Aliquot ב 2 צינורות מ&quot;ל ולאחסן ב 4 ° C. תמהיל העמוד 10X: מיקס 420.4 גרם של אוריאה, 100 מ&quot;ל של TBE 10X (autoclaved), 250 מ&quot;ל של 40% 29:1 Bis / acrylamide בDDH 2 O. מערבב עד שהיא נמסה לחלוטין ולהתאים את הנפח 1 ליטר. אחסן בבקבוקים כהים ב 4 ° C. TBE 10X: ממס 108 גרם לטריס, 55 גרם של חומצה בורה ו9.3 גרם של EDTA ב1 ליטר של DDH 2 O. חיטוי וחנות בטמפרטורת חדר. חיץ elution: לדלל 8 מ&quot;ל של 5 M NaCl, 2 מ&quot;ל של M TRIS pH 1 7.5, 0.4 מ&quot;ל של 0.5 מ &#39;EDTA pH 8 ב 200 מ&quot;ל של DDH 2 O. חיטוי וחנות בטמפרטורת חדר. </td></tr></tbody></table&gt;

iterative optimization of dna duplexes for crystallization of seqa-dna complexes

Escherichia coli SeqA הוא רגולטור שלילי של שכפול הדנ&quot;א שמונע פגי אירועי reinitiation לפי אשכולות GATC hemimethylated sequestering בתוך המקור של שכפול 1. מעבר למקור, SeqA נמצא במזלגות שהכפולים, שבו הוא מארגן את ה-DNA המשוכפל חדשה למבנים מסודרים גבוהים יותר 2. מקורבי SeqA רק בחולשה עם רצפי GATC בודדים, אבל הוא יוצר קומפלקסי זיקה גבוהות עם דופלקסים DNA המכילים אתרי GATC מרובים. היחידה התפקודית ומבנית המינימאלית של SeqA היא דימר, ובכך הסבירה את הדרישה של לפחות שני רצפי GATC כדי ליצור מורכבות-זיקה גבוהה עם DNA hemimethylated 3. בנוסף, ארכיטקטורת SeqA, עם oligomerization ותחומי ה-DNA מחייבים מופרדים מקשר גמיש, מאפשרת מחייבת לחוזר GATC המופרד עד שלושה סיבובי סליל. לפיכך, הבנת הפונקציה של SeqA ברמה מולקולרית דורשת ana המבניתמוגה של SeqA חייבת רצפי GATC מרובים. בהתגבשות החלבון ה-DNA, ה-DNA יכול להיות אף להשפעה יוצאת דופן על אינטראקציות האריזה בהתאם לגדלים והארכיטקטורה היחסיים של החלבונים והדנ&quot;א. אם החלבון הוא גדול יותר מאשר ה-DNA או טביעות רגליים של רוב ה-DNA, אריזת הגביש מתווכת בעיקר על ידי אינטראקציות בין חלבונים. לעומת זאת, כאשר החלבון הוא באותו גודל או קטן יותר מאשר DNA או שהוא מכסה חלק קטן של ה-DNA, ה-DNA DNA-DNA וחלבון האינטראקציות רק שולט אריזת גביש. לכן, התגבשות של קומפלקסים-DNA חלבון דורשת הקרנה השיטתית של 4 אורך הדנ&quot;א ומסתיים DNA (בוטה או סככה) 5-7. בדו&quot;ח זה, אנו מתארים כיצד לעצב, לייעל, לטהר ולהתגבש דופלקסים DNA המכילים hemimethylated חוזר טנדם GATC במתחם בוריאצית dimeric של SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) כדי לקבל גבישים מתאימים לקביעת מבנה.

Watch this Scientific Journal Video about Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes at JoVE.com

Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

מבנה הגבישי של קומפלקסים-DNA חלבון יכול לספק תובנות לגבי תפקוד חלבון, מנגנון, כמו גם, את אופי האינטראקציה הספציפית. כאן, אנו מדווחים איך לייעל את האורך, רצף וקצוות של DNA דופלקס להתגבשות שיתוף עם<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; SeqA, רגולטור שלילי של ייזום שכפול.

איטרטיבי אופטימיזציה של דופלקסים DNA להתגבשות של מכלולי SeqA-DNA

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

Research

JoVE Journal

Biology

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

חלבון התגבשות של קריסטלוגרפיה רנטגן

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

התגבשות של חלבונים בממברנה ב Mesophases Lipidic

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

תפוקה גבוהה התגבשות של חלבונים בממברנה שימוש בשיטה Lipidic Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

שימוש ברובוט להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בMesophases Lipidic

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

אופטימיזציה וניצול<em&gt; Agrobacterium</emייצור חלבון חלוף&gt; בתיווך ב<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

מיפוי מבוסס AFM של תכונות אלסטיות של קירות תא: ברקמות, נייד, והחלטות subcellular

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

דור וטיהור של מכלולי אדם INO80 הכרומטין שיפוץ וSubcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

ביטוי יעיל יונקים ניידים וטיהור חד צעד של תאי גליקופרוטאינים להתגבשות

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Electroporation, בידוד והדמיה של Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...