Name: iterative optimization of dna duplexes for crystallization of seqa-dna complexes
Uploaded: 2012-11-01T15:00:00
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Gli autori desiderano ringraziare il personale PXRR al NSLS (Brookhaven National Laboratory) per l&#39;assistenza durante la raccolta di dati e Monica Pillon aiuto per la purificazione del DNA. Questo lavoro è stato sostenuto dal Canadian Institutes of Health Research (MOP 67189).

1. Protein Purification Il linker flessibile che collega la N-(oligomerizzazione) e C-terminale (DNA binding) dominii Seqa aiuti riconoscimento dei hemimethylated ripetizioni GATC separate da 1-3 giri sul DNA. Per questo studio, abbiamo utilizzato una variante dimerica della Seqa (SeqAΔ (41-59)-A25R) con una mutazione puntiforme nel dominio N-terminale che impedisce l&#39;ulteriore oligomerizzazione e un linker accorciata che limita legante il DNA a tandem GATC ripete separati esclusivamente ...

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	<li>Campbell, J. L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+oriC+and+the+dnaA+gene+promoter+are+sequestered+from+dam+methyltransferase+following+the+passage+of+the+chromosomal+replication+fork.">E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork.</a> Cell. 62, 967-979 (1990).</li><li>Guarn&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+SeqA-N+filament:+implications+for+DNA+replication+and+chromosome+organization.">Crystal structure of a SeqA-N filament: implications for DNA replication and chromosome organization.</a> Embo. J. 24, 1502-1511 (2005).</li><li>Brendler, T., Austin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+SeqA+protein+to+DNA+requires+interaction+between+two+or+more+complexes+bound+to+separate+hemimethylated+GATC+sequences.">Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences.</a> Embo. J. 18, 2304-2310 (1999).</li><li>Jordan, S. R., Whitcombe, T. V., Berg, J. M., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+variation+in+DNA+length+yields+highly+ordered+repressor-operator+cocrystals.">Systematic variation in DNA length yields highly ordered repressor-operator cocrystals.</a> Science. 230, 1383-1385 (1985).</li><li>Tan, S., Hunziker, Y., Pellegrini, L., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+the+yeast+MATalpha2/MCM1/DNA+ternary+complex:+general+methods+and+principles+for+protein/DNA+cocrystallization.">Crystallization of the yeast MATalpha2/MCM1/DNA ternary complex: general methods and principles for protein/DNA cocrystallization.</a> J. Mol. Biol. 297, 947-959 (2000).</li><li>Rice, P. A., Yang, S., Mizuuchi, K., Nash, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+IHF-DNA+complex:+a+protein-induced+DNA+U-turn.">Crystal structure of an IHF-DNA complex: a protein-induced DNA U-turn.</a> Cell. 87, 1295-1306 (1996).</li><li>Yang, W., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+site-specific+recombinase+gamma+delta+resolvase+complexed+with+a+34+bp+cleavage+site.">Crystal structure of the site-specific recombinase gamma delta resolvase complexed with a 34 bp cleavage site.</a> Cell. 82, 193-207 (1995).</li><li>Chung, Y. S., Brendler, T., Austin, S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+cooperative+binding+of+SeqA+to+a+tandem+GATC+repeat.">Structural insights into the cooperative binding of SeqA to a tandem GATC repeat.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li><li>Anderson, J., Ptashne, M., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocrystals+of+the+DNA-binding+domain+of+phage+434+repressor+and+a+synthetic+phage+434+operator.">Cocrystals of the DNA-binding domain of phage 434 repressor and a synthetic phage 434 operator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1307-1311 (1984).</li><li>Timsit, Y., Moras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+self-fitting:+the+double+helix+directs+the+geometry+of+its+supramolecular+assembly.">DNA self-fitting: the double helix directs the geometry of its supramolecular assembly.</a> Embo J. 13, 2737-2746 (1994).</li><li>Chung, Y. S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+SeqA+bound+to+a+pair+of+hemimethylated+GATC+sites.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of SeqA bound to a pair of hemimethylated GATC sites.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 64, 567-571 (2008).</li><li>DeLano, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphic Systems. , (2002).</li></ol>

Una delle maggiori sfide nel macromolecolare cristallografia a raggi X è l&#39;ottenimento di cristalli di qualità di diffrazione. Nel caso di complessi proteici o proteine-DNA, questa sfida è aggravato a causa delle variabili aggiuntive che devono essere ottimizzati. Si crede che la lunghezza del DNA e la presenza di sbalzi appiccicose per migliorare associazione di molecole di DNA più vicini in un pseudo-duplex sono i principali parametri per ottimizzare. Tuttavia, abbiamo dimostrato che la natura e la lunghezza d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Catalogo # </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> TRIS </td><td> Bioshop </td><td> TRS003.5 </td><td></td></tr><tr><td> Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) </td><td> Fisher Scientific </td><td> E478-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiotheitrol (DTT) </td><td> Bio Base Inc. </td><td> DB0058 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Bioshop </td><td> SOD002.10 </td><td></td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Caledon </td><td> 5350-1 </td><td></td></tr><tr><td> Saccarosio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5016-500G </td><td></td></tr><tr><td> Di sodio dodecil solfato (SDS) </td><td> Bioshop </td><td> SDS001.500 </td><td></td></tr><tr><td> Urea </td><td> Bioshop </td><td> URE001.5 </td><td></td></tr><tr><td> 40% Bis 29:1 / acrilammide </td><td> Bio Base Inc. </td><td> A0007-500ml </td><td> Conservare a 4 ° C </td></tr><tr><td> Acido borico </td><td> EMD </td><td> BX0865-1 </td><td></td></tr><tr><td> Xilene cyanol FF </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0423 </td><td></td></tr><tr><td> Blu bromofenolo </td><td> Bioshop </td><td> BR0222 </td><td></td></tr><tr><td> Doppio sistema di regolazione verticale Gel </td><td> CBC Scientific Company Inc. </td><td> DASG-250 </td><td></td></tr><tr><td> Indice cristallizzazione schermo </td><td> Hampton ricerca </td><td> HR2-144 </td><td> Conservare a 4 ° C </td></tr><tr><td> I cristallizzazione guidata schermo </td><td> Emerald BioSystems </td><td> EBS-WIZ-1 </td><td> Conservare a 4 ° C </td></tr><tr><td> Wizard II cristallizzazione schermo </td><td&gt; Emerald BioSystems </td><td> EBS-WIZ-2 </td><td> Conservare a 4 ° C </td></tr><tr><td> Classics cristallizzazione schermo </td><td> Qiagen </td><td> 130701 </td><td> Conservare a 4 ° C </td></tr><tr><td> Intelliplate vassoi </td><td> Art Robbins Instruments </td><td> 102-0001-00 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Soluzioni Proteine ​​tampone purificazione: 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT e 5% glicerolo. Proteine ​​tampone di conservazione: 20 mM TRIS pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0,5 mM EDTA e il 5% glicerolo. Gel mix caricamento: Aggiungere 20 g di saccarosio, 25 mg di blu di bromofenolo, 25 mg di xilene cyanol FF, 1 ml di 10% w / v SDS e 10 ml di TBE 10X a 70 ml di autoclavato DDH 2 O. Mescolare con blando riscaldamento fino al saccarosio è sciolto e regolare la finaleil volume a 100 ml con autoclavato DDH 2 O. Conservare a 4 ° C. Loading buffer 2X: Aggiungere 11 g di urea a 10 ml di miscela di gel loading. Mescolare su una piastra calda fino urea si scioglie. Aliquotare in 2 provette ml e conservare a 4 ° C. PAGINA 10 volte mix: Mix 420,4 g di urea, 100 ml di TBE 10X (autoclave), 250 ml di 40% 29:1 Bis / acrilammide in DDH 2 O. Mescolare fino a quando completamente sciolto e regolare il volume a 1 litro. Conservare in bottiglie scure a 4 ° C. TBE 10X: sciogliere 108 g di TRIS, 55 g di acido borico e 9,3 g di EDTA in 1 litro di DDH 2 O. Autoclave e conservare a temperatura ambiente. Tampone di eluizione: Diluire 8 ml di NaCl 5 M, 2 ml di 1 M Tris pH 7,5, 0,4 ml di 0,5 M EDTA pH 8 su 200 ml di DDH 2 O. Autoclave e conservare a temperatura ambiente. </td></tr></tbody></table&gt;

iterative optimization of dna duplexes for crystallization of seqa-dna complexes

Escherichia coli Seqa è un regolatore negativo della replicazione del DNA che impedisce prematuri eventi reinitiation sequestrando cluster hemimethylated GATC entro l&#39;origine di replicazione 1. Al di là della provenienza, Seqa si trova a le forche di replicazione, dove organizza DNA appena replicato in un aumento delle strutture ordinate 2. Associa Seqa solo debolmente con singole sequenze GATC, ma forma complessi ad alta affinità con duplex di DNA contenenti più siti GATC. L&#39;unità minima funzionale e strutturale di Seqa è un dimero, spiegando così il requisito di almeno due sequenze GATC per formare un complesso ad alta affinità con DNA hemimethylated 3. Inoltre, l&#39;architettura Seqa, con l&#39;oligomerizzazione e DNA-legame domini separati da un linker flessibile, consente il collegamento di ripetizioni GATC separati da un massimo di tre spire elicoidali. Pertanto, comprendere la funzione di Seqa a livello molecolare richiede strutturale analisi di Seqa legata a più sequenze GATC. In proteina-DNA cristallizzazione, DNA può avere nessuno ad un eccezionale effetto sulle interazioni di imballaggio a seconda delle dimensioni relative e l&#39;architettura della proteina e del DNA. Se la proteina è più grande della DNA o impronte maggior parte del DNA, l&#39;imballaggio cristallo è mediata principalmente da interazioni proteina-proteina. Viceversa, quando la proteina è la stessa dimensione o minore del DNA o copre solo una frazione delle interazioni DNA, DNA-DNA e DNA-proteina dominano imballaggio cristallo. Pertanto, la cristallizzazione della proteina-DNA complessi richiede lo screening sistematico di 4 DNA lunghezza e termina DNA (smussato o sporgenza) 5-7. In questo rapporto, descriviamo come progettare, ottimizzare, purificare e cristallizzare duplex di DNA contenenti hemimethylated tandem ripete GATC in complesso con una variante dimerica di Seqa (SeqAΔ (41-59)-A25R) per ottenere cristalli adatti per la determinazione della struttura.

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Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

Struttura cristallina di proteine-DNA può fornire indicazioni in funzione della proteina, meccanismo, così come la natura dell&#39;interazione specifica. Qui, segnaliamo come ottimizzare la lunghezza, la sequenza e le estremità del DNA duplex per la co-cristallizzazione con<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Seqa, un regolatore negativo dell&#39;inizio della replicazione.

Ottimizzazione iterativa di duplex di DNA per cristallizzazione di Seqa-DNA Complessi

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

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