Name: iterative optimization of dna duplexes for crystallization of seqa-dna complexes
Uploaded: 2012-11-01T15:00:00
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著者らは、DNA精製のヘルプについては、データ収集とモニカPillon時の援助のためのNSLS（ブルックヘブン国立研究所）でPXRRのスタッフに感謝したいと思います。この作品は、カナダ衛生研究所（MOP 67189）によってサポートされていました。

1。タンパク質精製接続するフレキシブルリンカー、N-（オリゴマー）およびC末端（DNA結合）SeqAエイズ、DNA上の一から三ターンで区切らヘミメチルGATCリピートの認識のドメイン。この研究では、我々はさらに、オリゴマーとによって排他的に分離されたタンデムGATCへのDNA結合繰り返しを制限短縮しリンカを防ぎN末端ドメインに点突然変異とSeqAの二量体変異体（SeqAΔ（41?...

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	<li>Campbell, J. L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+oriC+and+the+dnaA+gene+promoter+are+sequestered+from+dam+methyltransferase+following+the+passage+of+the+chromosomal+replication+fork.">E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork.</a> Cell. 62, 967-979 (1990).</li><li>Guarn&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+SeqA-N+filament:+implications+for+DNA+replication+and+chromosome+organization.">Crystal structure of a SeqA-N filament: implications for DNA replication and chromosome organization.</a> Embo. J. 24, 1502-1511 (2005).</li><li>Brendler, T., Austin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+SeqA+protein+to+DNA+requires+interaction+between+two+or+more+complexes+bound+to+separate+hemimethylated+GATC+sequences.">Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences.</a> Embo. J. 18, 2304-2310 (1999).</li><li>Jordan, S. R., Whitcombe, T. V., Berg, J. M., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+variation+in+DNA+length+yields+highly+ordered+repressor-operator+cocrystals.">Systematic variation in DNA length yields highly ordered repressor-operator cocrystals.</a> Science. 230, 1383-1385 (1985).</li><li>Tan, S., Hunziker, Y., Pellegrini, L., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+the+yeast+MATalpha2/MCM1/DNA+ternary+complex:+general+methods+and+principles+for+protein/DNA+cocrystallization.">Crystallization of the yeast MATalpha2/MCM1/DNA ternary complex: general methods and principles for protein/DNA cocrystallization.</a> J. Mol. Biol. 297, 947-959 (2000).</li><li>Rice, P. A., Yang, S., Mizuuchi, K., Nash, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+IHF-DNA+complex:+a+protein-induced+DNA+U-turn.">Crystal structure of an IHF-DNA complex: a protein-induced DNA U-turn.</a> Cell. 87, 1295-1306 (1996).</li><li>Yang, W., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+site-specific+recombinase+gamma+delta+resolvase+complexed+with+a+34+bp+cleavage+site.">Crystal structure of the site-specific recombinase gamma delta resolvase complexed with a 34 bp cleavage site.</a> Cell. 82, 193-207 (1995).</li><li>Chung, Y. S., Brendler, T., Austin, S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+cooperative+binding+of+SeqA+to+a+tandem+GATC+repeat.">Structural insights into the cooperative binding of SeqA to a tandem GATC repeat.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li><li>Anderson, J., Ptashne, M., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocrystals+of+the+DNA-binding+domain+of+phage+434+repressor+and+a+synthetic+phage+434+operator.">Cocrystals of the DNA-binding domain of phage 434 repressor and a synthetic phage 434 operator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1307-1311 (1984).</li><li>Timsit, Y., Moras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+self-fitting:+the+double+helix+directs+the+geometry+of+its+supramolecular+assembly.">DNA self-fitting: the double helix directs the geometry of its supramolecular assembly.</a> Embo J. 13, 2737-2746 (1994).</li><li>Chung, Y. S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+SeqA+bound+to+a+pair+of+hemimethylated+GATC+sites.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of SeqA bound to a pair of hemimethylated GATC sites.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 64, 567-571 (2008).</li><li>DeLano, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphic Systems. , (2002).</li></ol>

高分子のX線結晶学における最大の課題の1つは、回折品質の結晶を得ることである。タンパク質またはタンパク質-DNA複合体の場合には、このチャレンジが最適化されなければならない追加の変数が原因で悪化している。それは広く利用されているDNAの長さと粘り気のオーバーハングの存在は長く擬似二重に隣接するDNA分子の関連付けを強化すると考えられている最適化するための主要なパラ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ＃ </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>トリス</td><td> Bioshop </td><td> TRS003.5 </td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸（EDTA） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> E478-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiotheitrolトール（DTT） </td><td>基本バイオ株式会社</td><td> DB0058 </td><td></td></tr><tr><td> NaClを</td><td> Bioshop </td><td> SOD002.10 </td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>カレドン</td><td> 5350から1 </td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S5016-500G </td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム（SDS） </td><td> Bioshop </td><td> SDS001.500 </td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td> Bioshop </td><td> URE001.5 </td><td></td></tr><tr><td> 40パーセント29:1ビス/アクリルアミド</td><td>基本バイオ株式会社</td><td> A0007-500ML </td><td> 4℃で保存</td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td> EMD </td><td> BX0865-1 </td><td></td></tr><tr><td>キシレンシアノールFF </td><td>バイオ·ラッド</td><td> 161-0423 </td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td> Bioshop </td><td> BR0222 </td><td></td></tr><tr><td>デュアル可変垂直ゲルシステム</td><td> CBCのサイエンティフィック·カンパニー·インク</td><td> DASG-250 </td><td></td></tr><tr><td>インデックス晶画面</td><td>ハンプトンリサーチ</td><td> HR2-144 </td><td> 4℃で保存</td></tr><tr><td>ウィザード私は結晶化画面</td><td>エメラルドアプライドバイオシステムズ</td><td> EBS-WIZ-1 </td><td> 4℃で保存</td></tr><tr><td>ウィザードIIの結晶化画面</td><td&gt;エメラルドアプライドバイオシステムズ</td><td> EBS-WIZ-2 </td><td> 4℃で保存</td></tr><tr><td>クラシック結晶化画面</td><td>キアゲン</td><td> 130701 </td><td> 4℃で保存</td></tr><tr><td> Intelliplateトレー</td><td>アートロビンスインスツルメンツ</td><td> 102-0001-00 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>ソリューション タンパク質精製バッファー：100 mMトリスpH 8、2mMのEDTA、2mMのDTT、5％グリセロール。 タンパク質貯蔵バッファー：20 mMトリスpH 8、150mMのNaCl、5mMのDTT、0.5mMのEDTA、5％グリセロール。 ゲルローディングミックス：オートクレーブ滅菌蒸留H 2 Oの70ミリリットルにショ糖の20グラム、ブロモフェノールブルーを25mg、キシレンシアノールFFの25mg、10％（w / v）のSDSおよび10X TBEの10ミリリットルの1ミリリットルを追加ショ糖が溶解するまで穏やかに加熱して攪拌し、最終的な調整オートクレーブ滅菌蒸留H 2 Oで100mlにボリューム4℃で保存する 2Xローディングバッファー：ゲルローディングミックス10mlに尿素の11グラムを追加します。尿素が溶けるまで、ホットプレート上でかき混ぜる。 4で2 mlチューブ内や店舗内にアリコート℃、 10Xホームページミックス：ミックス尿素の420.4グラム、10X TBEの100ミリリットル（オートクレーブ）、40％、250mlの29:1のddH 2 Oのビス/アクリルアミド完全に溶解するまで攪拌し、1リットルにボリュームを調整します。 4℃の暗所に保管してボトル 10X TBE：ディゾルブ 108グラム トリス、蒸留H 2 Oの1リットル中のホウ酸の55グラムとEDTAの9.3グラムの室温でオートクレーブや店舗。 溶出緩衝液：蒸留H 2 Oの200ミリリットルの5 M NaClを、1Mトリス（pH7.5）、0.5MのEDTA pHが8の0.4ミリリットルの2ミリリットルの希薄8ミリリットル室温でオートクレーブや店舗。 </td></tr></tbody></tabLE&gt;

iterative optimization of dna duplexes for crystallization of seqa-dna complexes

大腸菌 SeqAは複製1の原点内封鎖ヘミメチルGATCクラスターによる早期再開始イベントを防ぐDNA複製の負の調節因子である。原点を超えて、SeqAは複製フォーク、それがより高い秩序構造に新しく複製されたDNAを整理2で見出される。 SeqAシングルGATC配列と共に弱くしか仲間が、それは複数GATC部位を含むDNA二重鎖と親和性の高い複合体を形成している。 SeqAの最小限の機能と構造単位は、それによってヘミメチル化DNA 3と高親和性複合体を形成するために少なくとも2つのGATCシーケンスの要件を説明し、二量体である。さらに、SeqAアーキテクチャは、オリゴマー化と柔軟なリンカーによって分離されたDNA結合ドメインと、3つの螺旋回転までで区切らGATCリピートに結合することができます。したがって、分子レベルでSeqAの機能を理解することは構造的アナログを必要と複数GATC配列に結合SeqAの溶解。タンパク質-DNAの結晶化では、DNAはタンパク質とDNAの相対サイズとアーキテクチャに応じてパッキング相互作用に非常に優れた効果をnoneに持つことはできません。タンパク質はDNAまたはDNAの足跡のほとんどよりも大きい場合には、結晶充填は、主に、タンパク質 - タンパク質相互作用によって媒介される。逆に、タンパク質はDNAよりも同じサイズ以下であるか、またはそれが唯一のDNA、DNA-DNAとDNA-タンパク質相互作用の一部をカバーするとき、結晶パッキングを支配している。したがって、タンパク質-DNA複合体の結晶化は、DNAの長さ4、DNA末端（鈍またはオーバーハング）5-7の体系的スクリーニングを必要とします。本稿では、設計、最適化、精製および構造決定に適した結晶を得ることがSeqAの二量体変異体（SeqAΔ（41から59）-A25R）と複合したタンデムGATCリピートを含むヘミメチル化DNA二重鎖を結晶化する方法について説明します。

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Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

タンパク質-DNA複合体の結晶構造は、タンパク質の機能、機構、ならびに、特定の相互作用の性質についての洞察を提供することができます。ここでは、との共結晶の長さ、配列および二本鎖DNAの末端を最適化する方法を報告して<em&gt;大腸菌</em&gt; SeqA、複製開始の負の調節因子。

SeqA-DNA複合体の結晶化のためのDNA二重鎖の反復最適化

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

Research

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Biology

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