Name: iterative optimization of dna duplexes for crystallization of seqa-dna complexes
Uploaded: 2012-11-01T15:00:00
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저자는 DNA 정화와 관련하여 도움이 데이터 수집 및 모니카 Pillon 동안 도움을 NSLS (브룩 헤이븐 국립 연구소)에서 PXRR 직원을 감사하고 싶습니다. 이 작품은 건강 연구의 캐나다 연구소 (걸레 67189)에 의해 지원되었다.

1. 단백질 정제 연결 유연 링커 N-(oligomerization)와 C-터미널 (DNA 바인딩) SeqA 에이즈 DNA에 1-3 회전으로 ​​구분 hemimethylated GATC 반복의 인식 도메인입니다. 본 연구의 경우, 우리는 더 oligomerization과에 의해 독점적으로 구분 직렬 GATC에게 구속력 DNA 반복을 제한 단축 링커을 방지 N-터미널 도메인의 점 돌연변이로 SeqA의 dimeric 변종 (SeqAΔ (41-59) A25R)를 사용 DNA 하나 턴 (그림 1)</s...

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	<li>Campbell, J. L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+oriC+and+the+dnaA+gene+promoter+are+sequestered+from+dam+methyltransferase+following+the+passage+of+the+chromosomal+replication+fork.">E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork.</a> Cell. 62, 967-979 (1990).</li><li>Guarn&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+SeqA-N+filament:+implications+for+DNA+replication+and+chromosome+organization.">Crystal structure of a SeqA-N filament: implications for DNA replication and chromosome organization.</a> Embo. J. 24, 1502-1511 (2005).</li><li>Brendler, T., Austin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+SeqA+protein+to+DNA+requires+interaction+between+two+or+more+complexes+bound+to+separate+hemimethylated+GATC+sequences.">Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences.</a> Embo. J. 18, 2304-2310 (1999).</li><li>Jordan, S. R., Whitcombe, T. V., Berg, J. M., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+variation+in+DNA+length+yields+highly+ordered+repressor-operator+cocrystals.">Systematic variation in DNA length yields highly ordered repressor-operator cocrystals.</a> Science. 230, 1383-1385 (1985).</li><li>Tan, S., Hunziker, Y., Pellegrini, L., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+the+yeast+MATalpha2/MCM1/DNA+ternary+complex:+general+methods+and+principles+for+protein/DNA+cocrystallization.">Crystallization of the yeast MATalpha2/MCM1/DNA ternary complex: general methods and principles for protein/DNA cocrystallization.</a> J. Mol. Biol. 297, 947-959 (2000).</li><li>Rice, P. A., Yang, S., Mizuuchi, K., Nash, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+IHF-DNA+complex:+a+protein-induced+DNA+U-turn.">Crystal structure of an IHF-DNA complex: a protein-induced DNA U-turn.</a> Cell. 87, 1295-1306 (1996).</li><li>Yang, W., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+site-specific+recombinase+gamma+delta+resolvase+complexed+with+a+34+bp+cleavage+site.">Crystal structure of the site-specific recombinase gamma delta resolvase complexed with a 34 bp cleavage site.</a> Cell. 82, 193-207 (1995).</li><li>Chung, Y. S., Brendler, T., Austin, S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+cooperative+binding+of+SeqA+to+a+tandem+GATC+repeat.">Structural insights into the cooperative binding of SeqA to a tandem GATC repeat.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li><li>Anderson, J., Ptashne, M., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocrystals+of+the+DNA-binding+domain+of+phage+434+repressor+and+a+synthetic+phage+434+operator.">Cocrystals of the DNA-binding domain of phage 434 repressor and a synthetic phage 434 operator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1307-1311 (1984).</li><li>Timsit, Y., Moras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+self-fitting:+the+double+helix+directs+the+geometry+of+its+supramolecular+assembly.">DNA self-fitting: the double helix directs the geometry of its supramolecular assembly.</a> Embo J. 13, 2737-2746 (1994).</li><li>Chung, Y. S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+SeqA+bound+to+a+pair+of+hemimethylated+GATC+sites.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of SeqA bound to a pair of hemimethylated GATC sites.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 64, 567-571 (2008).</li><li>DeLano, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphic Systems. , (2002).</li></ol>

macromolecular X-선 결정학에서 가장 큰 도전 중 하나는 회절 품질 결정을 획득하고 있습니다. 단백질 또는 단백질 DNA 단지의 경우,이 도전은 최적화되어야합니다 추가 변수로 인해 악화됩니다. 그것은 널리 DNA의 길이와 끈적 overhangs의 존재가 더 이상 가상 이중의 주요 매개 변수를 최적화하는 것입니다에 인접한 DNA 분자의 연결을 강화하기 졌다고합니다. 그러나, 우리는 이러한 overhangs의 특성과 길?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 # </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 트리스 </td><td> Bioshop </td><td> TRS003.5 </td><td></td></tr><tr><td> Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) </td><td> 피셔 과학 </td><td> E478-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiotheitrol (DTT) </td><td> 바이오 기본 주식회사 </td><td> DB0058 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Bioshop </td><td> SOD002.10 </td><td></td></tr><tr><td> 글리세린 </td><td> Caledon </td><td> 5350-1 </td><td></td></tr><tr><td> 자당 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> S5016-500G </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 dodecyl 황산 (SDS) </td><td> Bioshop </td><td> SDS001.500 </td><td></td></tr><tr><td> 요소 </td><td> Bioshop </td><td> URE001.5 </td><td></td></tr><tr><td> 40% 29:1 BIS / 아크릴 아미드 </td><td> 바이오 기본 주식회사 </td><td> A0007-500ml </td><td> 4에 저장 ° C </td></tr><tr><td> 붕산 </td><td> EMD </td><td> BX0865-1 </td><td></td></tr><tr><td> 크실렌 cyanol FF </td><td> 바이오 RAD </td><td> 161-0423 </td><td></td></tr><tr><td> Bromophenol 블루 </td><td> Bioshop </td><td> BR0222 </td><td></td></tr><tr><td> 이중 조절 수직 젤 시스템 </td><td> CBC 과학 회사 주식회사 </td><td> DASG-250 </td><td></td></tr><tr><td> 인덱스 결정화 화면 </td><td> 햄튼 연구 </td><td> HR2-144 </td><td> 4에 저장 ° C </td></tr><tr><td> 마법사 I의 결정 화면 </td><td> 에메랄드 BioSystems </td><td> EBS-마법사-1 </td><td> 4에 저장 ° C </td></tr><tr><td> 마법사 II의 결정 화면 </td><td&gt; 에메랄드 BioSystems </td><td> EBS-마법사-2 </td><td> 4에 저장 ° C </td></tr><tr><td> 클래식 결정 화면 </td><td> Qiagen </td><td> 130701 </td><td> 4에 저장 ° C </td></tr><tr><td> Intelliplate 트레이 </td><td> 예술 로빈스 악기 </td><td> 102-0001-00 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 솔루션 단백질 정화 버퍼 : 100 MM 트리스 산도 8, 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 2 MM DTT와 5 % 글리세롤. 단백질 저장 버퍼 : 20 MM 트리스 산도 8, 150 MM NaCl, 5 MM DTT, 0.5 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 및 5 % 글리세롤. 젤 로딩 믹스 : autoclaved ddH 2 O.의 70 ML에 자당의 20g, bromophenol 파란색의 25 밀리그램, 크실렌 cyanol FF의 25 밀리그램, 10 % w / V SDS의 1 ML과 10X TBE의 10 ML을 추가 자당이 용해 될 때까지 약한 난방 저어 및 최종을 조절볼륨 100 autoclaved ddH 2 O.있는 ML 4 ° C.에 저장 2X로드 버퍼 : 젤 로딩 믹스의 10 ML에 요소의 11g을 추가합니다. 요소가 해소 될 때까지 뜨거운 접시에 젓는다. 4 2 ML 튜브 및 매장에서 나누어지는 ° C. 10X PAGE 믹스 : 믹스 요소의 420.4 g, 10X TBE의 100 ML (autoclaved), 40 % 250 ML 29:1 ddH 2 O.에서 BIS / 아크릴 아미드 완전히 용해 될 때까지 저어 및 1리터에 볼륨을 조정할 수 있습니다. 4 ° C.에서 어두운 병에 저장 10X TBE : 디졸브 108g 트리스, ddH 2 O. 1 리터에 붕산의 55g과 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 9.3 g의 상온에서 압력솥 및 매장. 용출 버퍼 : ddH 2 O. 200 ML 5 M NaCl, 1 M 트리스 산도 7.5, 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 산도 8 0.4 ML 2 ML의 희석 8 ML 상온에서 압력솥 및 매장. </td></tr></tbody></tab르&gt;

iterative optimization of dna duplexes for crystallization of seqa-dna complexes

에스 케리 키아 대장균 SeqA 복제 1의 기원에서 sequestering hemimethylated GATC 클러스터의 조기 reinitiation 이벤트를 방지 DNA 복제의 부정적인 레귤레이터입니다. 원산지 외에도 SeqA은 복제 포크, 그것이 높은 명령 구조로 새로 복제 된 DNA를 구성 2 발견됩니다. SeqA 동료는 약하게 하나의 GATC 시퀀스로하지만, 여러 GATC 사이트를 포함하는 DNA의 duplexes 높은 친화 단지를 형성한다. SeqA의 최소한의 기능 및 구조 단위는이를 hemimethylated DNA 3 고친 화성 단지를 ​​형성하는 적어도 두 개의 GATC 시퀀스의 요구 사항을 설명하고, 이량 체입니다. 또한, oligomerization과 유연한 링커로 구분하여 DNA 결합 도메인 SeqA 아키텍처, 3 나선형 회전까지로 구분 GATC 반복에 바인딩 할 수 있습니다. 따라서, 분자 수준에서 SeqA의 기능을 이해하는 것은 구조적 아나가 필요합니다SeqA의 용해는 여러 GATC 시퀀스에 바인딩. 단백질 DNA의 결정에서 DNA는 단백질과 DNA의 상대적인 크기와 건축에 따라 포장의 상호 작용에 탁월한 효과 하나도 없다. 단백질은 DNA 나 발자국 DNA의 대부분을보다 큰 경우, 크리스탈 포장은 주로 단백질 단백질 상호 작용에 의해 중재됩니다. 반대로, 단백질이 DNA보다 같은 크기 또는 작은 또는 만 DNA, DNA-DNA 및 DNA-단백질 상호 작용의 일부를 포함 할 때 크리스탈 포장을 지배. 따라서, 단백질 DNA 단지의 결정은 DNA의 길이 4 DNA 종료 (둔기 나 오버행) 5-7의 체계적인 심사가 필요합니다. 이 보고서에서, 우리는 설계, 최적화, 정화 및 구조 결정에 적합한 결정을 얻을 수 SeqA의 dimeric 변형 (SeqAΔ (41-59) - A25R)으로 단지에 나란히 GATC 반복을 포함 hemimethylated의 DNA duplexes을 결정화하는 방법에 대해 설명합니다.

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Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

단백질 DNA 단지의 결정 구조는 단백질 기능, 메커니즘뿐만 아니라, 특정 상호 작용의 성격에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 여기, 우리는 함께 공동 결정의 길이, 순서 및 이중 DNA의 끝을 최적화하는 방법을보고<em&gt; 대장균</em&gt; SeqA, 복제 개시의 네거티브 레귤레이터.

SeqA-DNA 단지의 결정에 대한 DNA의 Duplexes의 최적화를 반복

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

Research

JoVE Journal

Biology

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

X - 선 Crystallography에 대한 단백질 결정화

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

연구

생물학

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 결정화

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Lipidic Bicelle 방법을 사용하여 막 단백질의 높은 처리량 결정

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 높은 처리량을 결정하기위한 로봇의 사용

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

최적화 및 활용<em&gt; 아그로 박테 리움</em에서&gt; 매개 과도 단백질 생산<em&gt;는 담배</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

셀 벽의 탄성 특성의 AFM 기반의 매핑 : 조직, 세포 및 세포 이하의 해상도에서

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

비례 생체 분자 비콘을 사용하여 살아있는 세포의 단일 엔지니어링 RNA 성적 증명서의 실시간 영상

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

세대와 인간의 INO80 염색질 리모델링 단지 및 서브 콤플렉스의 정화

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

효율적인 포유 동물 세포 발현 및 결정화에 대한 세포 외 당 단백질의 단일 단계 정화

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA 일렉트로, 근섬유의 분리 및 이미징

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...