Name: iterative optimization of dna duplexes for crystallization of seqa-dna complexes
Uploaded: 2012-11-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke PXRR ansatte ved NSLS (Brookhaven National Laboratory) for å få hjelp i løpet av datainnsamling og Monica Pillon for hjelp med DNA rensing. Dette arbeidet ble støttet av den kanadiske Institutes of Health Research (MOP 67189).

1. Proteinrensing Den fleksible linker kobler N-(oligomerisering) og C-terminale (DNA-binding) domener av SeqA hjelpemidler anerkjennelse av hemimethylated GATC gjentar separert med 1-3 omdreininger på DNA. For denne studien brukte vi en dimerglycerol variant av SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) med en punktmutasjon i det N-terminale domenet som forhindrer ytterligere oligomerisering og en forkortet linker som begrenser DNA-binding til tandem GATC gjentar separert eksklusivt av en omdreining på DNA...

<ol>
	<li>Campbell, J. L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+oriC+and+the+dnaA+gene+promoter+are+sequestered+from+dam+methyltransferase+following+the+passage+of+the+chromosomal+replication+fork.">E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork.</a> Cell. 62, 967-979 (1990).</li><li>Guarn&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+SeqA-N+filament:+implications+for+DNA+replication+and+chromosome+organization.">Crystal structure of a SeqA-N filament: implications for DNA replication and chromosome organization.</a> Embo. J. 24, 1502-1511 (2005).</li><li>Brendler, T., Austin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+SeqA+protein+to+DNA+requires+interaction+between+two+or+more+complexes+bound+to+separate+hemimethylated+GATC+sequences.">Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences.</a> Embo. J. 18, 2304-2310 (1999).</li><li>Jordan, S. R., Whitcombe, T. V., Berg, J. M., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+variation+in+DNA+length+yields+highly+ordered+repressor-operator+cocrystals.">Systematic variation in DNA length yields highly ordered repressor-operator cocrystals.</a> Science. 230, 1383-1385 (1985).</li><li>Tan, S., Hunziker, Y., Pellegrini, L., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+the+yeast+MATalpha2/MCM1/DNA+ternary+complex:+general+methods+and+principles+for+protein/DNA+cocrystallization.">Crystallization of the yeast MATalpha2/MCM1/DNA ternary complex: general methods and principles for protein/DNA cocrystallization.</a> J. Mol. Biol. 297, 947-959 (2000).</li><li>Rice, P. A., Yang, S., Mizuuchi, K., Nash, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+IHF-DNA+complex:+a+protein-induced+DNA+U-turn.">Crystal structure of an IHF-DNA complex: a protein-induced DNA U-turn.</a> Cell. 87, 1295-1306 (1996).</li><li>Yang, W., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+site-specific+recombinase+gamma+delta+resolvase+complexed+with+a+34+bp+cleavage+site.">Crystal structure of the site-specific recombinase gamma delta resolvase complexed with a 34 bp cleavage site.</a> Cell. 82, 193-207 (1995).</li><li>Chung, Y. S., Brendler, T., Austin, S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+cooperative+binding+of+SeqA+to+a+tandem+GATC+repeat.">Structural insights into the cooperative binding of SeqA to a tandem GATC repeat.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li><li>Anderson, J., Ptashne, M., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocrystals+of+the+DNA-binding+domain+of+phage+434+repressor+and+a+synthetic+phage+434+operator.">Cocrystals of the DNA-binding domain of phage 434 repressor and a synthetic phage 434 operator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1307-1311 (1984).</li><li>Timsit, Y., Moras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+self-fitting:+the+double+helix+directs+the+geometry+of+its+supramolecular+assembly.">DNA self-fitting: the double helix directs the geometry of its supramolecular assembly.</a> Embo J. 13, 2737-2746 (1994).</li><li>Chung, Y. S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+SeqA+bound+to+a+pair+of+hemimethylated+GATC+sites.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of SeqA bound to a pair of hemimethylated GATC sites.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 64, 567-571 (2008).</li><li>DeLano, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphic Systems. , (2002).</li></ol>

En av de største utfordringene i macromolecular røntgenkrystallografi er å skaffe diffraksjon kvalitet krystaller. I tilfelle av protein eller protein-DNA komplekser, er denne utfordringen forverret på grunn av de ytterligere variabler som må optimaliseres. Det er antatt at lengden av DNA og tilstedeværelsen av klebrige overheng for å forbedre sammenslutning av nabo DNA molekyler i en lengre pseudo-dupleks er de viktigste parametre for å optimalisere. Imidlertid, har vi vist at naturen og lengden av disse overhe...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navnet på reagensen </td><td> Selskapet </td><td> Katalog # </td><td> Kommentarer (valgfritt) </td></tr><tr><td> TRIS </td><td> Bioshop </td><td> TRS003.5 </td><td></td></tr><tr><td> Etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) </td><td> Fisher Scientific </td><td> E478-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiotheitrol (DTT) </td><td> Bio Basic Inc. </td><td> DB0058 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Bioshop </td><td> SOD002.10 </td><td></td></tr><tr><td> Glyserol </td><td> Caledon </td><td> 5350-1 </td><td></td></tr><tr><td> Sukrose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5016-500G </td><td></td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfat (SDS) </td><td> Bioshop </td><td> SDS001.500 </td><td></td></tr><tr><td> Urea </td><td> Bioshop </td><td> URE001.5 </td><td></td></tr><tr><td> 40% 29:1 Bis / akrylamid </td><td> Bio Basic Inc. </td><td> A0007-500ml </td><td> Oppbevar ved 4 ° C </td></tr><tr><td> Borsyre </td><td> EMD </td><td> BX0865-1 </td><td></td></tr><tr><td> Xylen cyanol FF </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0423 </td><td></td></tr><tr><td> Bromophenol Blå </td><td> Bioshop </td><td> BR0222 </td><td></td></tr><tr><td> Dual Justerbar vertikal Gel System </td><td> CBC Scientific Company Inc. </td><td> DASG-250 </td><td></td></tr><tr><td> Indeks krystallisering skjermen </td><td> Hampton Forskning </td><td> HR2-144 </td><td> Oppbevar ved 4 ° C </td></tr><tr><td> Wizard I krystallisering skjermen </td><td> Emerald BioSystems </td><td> EBS-Wiz-1 </td><td> Oppbevar ved 4 ° C </td></tr><tr><td> Wizard II krystallisering skjermen </td><td&gt; Emerald BioSystems </td><td> EBS-Wiz-2 </td><td> Oppbevar ved 4 ° C </td></tr><tr><td> Classics krystallisering skjermen </td><td> Qiagen </td><td> 130701 </td><td> Oppbevar ved 4 ° C </td></tr><tr><td> Intelliplate skuffer </td><td> Art Robbins Instruments </td><td> 102-0001-00 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Løsninger Proteinrensing buffer: 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT og 5% glycerol. Protein lagringsbuffer: 20 mM TRIS pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0,5 mM EDTA og 5% glycerol. Gel loading mix: Tilsett 20 g sukrose, 25 mg bromophenol blå, 25 mg av xylen cyanol FF, 1 ml 10% w / v SDS, og 10 ml med 10X TBE til 70 ml autoklavert DDH 2 O. Rør med mild oppvarming inntil sukrose oppløses og justering av den endeligevolum til 100 ml med autoklaverte DDH 2 O. Oppbevar ved 4 ° C. 2X lasting buffer: Legg 11 g urea til 10 ml av gel lasting blanding. Rør på en varm plate til urea oppløst. Delmengde i 2 ml rør og lagre ved 4 ° C. 10X SIDE mix: Bland 420,4 g urea, 100 ml 10X TBE (autoklavert), 250 ml 40% 29:1 Bis / Akrylamid i DDH 2 O. Omrør inntil alt oppløst og justere volumet til 1 liter. Lagre i mørke flasker ved 4 ° C. 10X TBE: Løs 108 g av TRIS, 55 g borsyre og 9,3 g EDTA i 1 liter DDH 2 O. Autoklaven og oppbevar ved romtemperatur. Elueringsbuffer: Fortynn 8 ml 5 M NaCl, 2 ml 1 M Tris pH 7,5, 0,4 ml 0,5 M EDTA pH 8 på 200 ml DDH 2 O. Autoklaven og oppbevar ved romtemperatur. </td></tr></tbody></table&gt;

iterative optimization of dna duplexes for crystallization of seqa-dna complexes

Escherichia coli SeqA er en negativ regulator av DNA replikasjon som hindrer for tidlig reinitiation hendelser etter avsondringsmidler hemimethylated GATC klynger innenfor replikasjonsorigo en. Utover opprinnelse, er SeqA funnet på replikering gafler, hvor den organiserer nylig kopiert DNA i høyere beordret strukturer to. SeqA knytter bare svakt med enkle GATC sekvenser, men den danner høy affinitet komplekser med DNA duplexes inneholder flere GATC nettsteder. Minimal funksjonell og strukturell enhet av SeqA er en dimer, og dermed forklarer kravet om minst to GATC sekvenser for å danne en høyaffinitets-kompleks med hemimethylated DNA 3. I tillegg tillater SeqA arkitekturen med oligomerisering og DNA-bindende domener som er atskilt med en fleksibel linker, binding til GATC gjentar atskilt av opptil tre skrueformede omdreininger. Derfor å forstå funksjonen av SeqA på et molekylært nivå krever strukturelle analysis av SeqA bundet til flere GATC sekvenser. I protein-DNA krystallisering, kan DNA ha ingen til en eksepsjonell effekt på pakking interaksjoner avhengig av den relative størrelse og arkitektur av proteinet og DNA. Hvis proteinet er større enn DNA eller overføringene fleste av DNA, blir krystall pakking hovedsak mediert av protein-protein interaksjoner. Omvendt, når proteinet er av samme størrelse eller mindre enn DNA eller den bare dekker en brøkdel av de DNA, DNA-DNA og DNA-protein interaksjoner dominerer krystall pakking. Derfor krever krystallisering av protein-DNA komplekser systematisk screening av DNA lengde 4 og DNA ender (sløv eller overheng) 5-7. I denne rapporten beskriver vi hvordan å designe, optimalisere, rense og krystallisere hemimethylated DNA duplexes inneholder tandem GATC gjentar i komplekset med en dimerglycerol variant av SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) for å få krystaller egnet for strukturbestemmelse.

Watch this Scientific Journal Video about Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes at JoVE.com

Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

Krystallstruktur av protein-DNA komplekser kan gi innsikt i protein funksjon, mekanisme, samt, arten av den spesifikke interaksjon. Her rapporterer vi hvordan du kan optimalisere lengden, rekkefølge og ender dupleks DNA for co-krystallisering med<em&gt; Escherichia coli</em&gt; SeqA, en negativ regulator av replikering innvielse.

Iterativ Optimalisering av DNA Duplex for krystallisering av SeqA-DNA komplekser

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

Research

JoVE Journal

Biology

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

High-throughput krystallisering av membran proteiner Bruke Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Bruk av en robot for High-throughput Krystallisering av membran proteiner i Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimalisering og utnyttelse av<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Mediert Transient Protein Produksjonen i<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

AFM-baserte Kartlegging av de elastiske egenskapene Cell Vegger: ved Tissue, Cellular, og subcellulære resolusjoner

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Real-time Imaging av Enkelt Engineered RNA transkripsjoner i levende celler ved hjelp Proporsjonellekspansjon bimolekylære Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Generasjon og rensing av menneske INO80 Chromatin remodeling komplekser og Subcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Effektiv pattedyrcelle Expression og Single-step Rensing av Ekstracellulær Glykoproteiner for Krystallisering

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Electroporation, Isolering og Imaging av Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...