Name: iterative optimization of dna duplexes for crystallization of seqa-dna complexes
Uploaded: 2012-11-01T15:00:00
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Os autores gostariam de agradecer ao pessoal PXRR no NSLS (Brookhaven National Laboratory) para a assistência durante a coleta de dados e Pillon Monica para ajuda com a purificação do DNA. Este trabalho foi financiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (MOP 67.189).

1. Protein Purification O ligante flexível que liga o. N-(oligomerização) e C-terminal (de ligação ao ADN), domínios de SEQA auxilia o reconhecimento de hemimethylated repete GATC separadas por 1-3 voltas sobre o DNA Para este estudo, utilizou-se uma variante de SEQA dimérica (SeqAΔ (41-59)-A25R) com um ponto de mutação no domínio N-terminal que impede ainda mais a oligomerização e um linker encurtado que restringe a ligação a DNA em tandem GATC repete separada exclusivamente pe...

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	<li>Campbell, J. L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+oriC+and+the+dnaA+gene+promoter+are+sequestered+from+dam+methyltransferase+following+the+passage+of+the+chromosomal+replication+fork.">E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork.</a> Cell. 62, 967-979 (1990).</li><li>Guarn&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+SeqA-N+filament:+implications+for+DNA+replication+and+chromosome+organization.">Crystal structure of a SeqA-N filament: implications for DNA replication and chromosome organization.</a> Embo. J. 24, 1502-1511 (2005).</li><li>Brendler, T., Austin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+SeqA+protein+to+DNA+requires+interaction+between+two+or+more+complexes+bound+to+separate+hemimethylated+GATC+sequences.">Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences.</a> Embo. J. 18, 2304-2310 (1999).</li><li>Jordan, S. R., Whitcombe, T. V., Berg, J. M., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+variation+in+DNA+length+yields+highly+ordered+repressor-operator+cocrystals.">Systematic variation in DNA length yields highly ordered repressor-operator cocrystals.</a> Science. 230, 1383-1385 (1985).</li><li>Tan, S., Hunziker, Y., Pellegrini, L., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+the+yeast+MATalpha2/MCM1/DNA+ternary+complex:+general+methods+and+principles+for+protein/DNA+cocrystallization.">Crystallization of the yeast MATalpha2/MCM1/DNA ternary complex: general methods and principles for protein/DNA cocrystallization.</a> J. Mol. Biol. 297, 947-959 (2000).</li><li>Rice, P. A., Yang, S., Mizuuchi, K., Nash, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+IHF-DNA+complex:+a+protein-induced+DNA+U-turn.">Crystal structure of an IHF-DNA complex: a protein-induced DNA U-turn.</a> Cell. 87, 1295-1306 (1996).</li><li>Yang, W., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+site-specific+recombinase+gamma+delta+resolvase+complexed+with+a+34+bp+cleavage+site.">Crystal structure of the site-specific recombinase gamma delta resolvase complexed with a 34 bp cleavage site.</a> Cell. 82, 193-207 (1995).</li><li>Chung, Y. S., Brendler, T., Austin, S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+cooperative+binding+of+SeqA+to+a+tandem+GATC+repeat.">Structural insights into the cooperative binding of SeqA to a tandem GATC repeat.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li><li>Anderson, J., Ptashne, M., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocrystals+of+the+DNA-binding+domain+of+phage+434+repressor+and+a+synthetic+phage+434+operator.">Cocrystals of the DNA-binding domain of phage 434 repressor and a synthetic phage 434 operator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1307-1311 (1984).</li><li>Timsit, Y., Moras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+self-fitting:+the+double+helix+directs+the+geometry+of+its+supramolecular+assembly.">DNA self-fitting: the double helix directs the geometry of its supramolecular assembly.</a> Embo J. 13, 2737-2746 (1994).</li><li>Chung, Y. S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+SeqA+bound+to+a+pair+of+hemimethylated+GATC+sites.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of SeqA bound to a pair of hemimethylated GATC sites.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 64, 567-571 (2008).</li><li>DeLano, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphic Systems. , (2002).</li></ol>

Um dos maiores desafios em cristalografia macromolecular de raios-X é a obtenção de cristais de qualidade de difração. No caso de complexos de proteínas ou proteína-DNA, este desafio é agravado devido às variáveis ​​adicionais que devem ser optimizadas. Acredita-se que o comprimento do DNA e a presença de saliências pegajosas para melhorar associação de moléculas de DNA adjacentes a mais longo pseudo-duplex são os principais parâmetros para optimizar. No entanto, mostraram que a natureza e extensão...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Catálogo # </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> TRIS </td><td> Bioshop </td><td> TRS003.5 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA) </td><td> Fisher Scientific </td><td> E478-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiotheitrol (TDT) </td><td> Bio Básico Inc. </td><td> DB0058 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Bioshop </td><td> SOD002.10 </td><td></td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Caledon </td><td> 5350-1 </td><td></td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5016-500G </td><td></td></tr><tr><td> Dodecilsulfato de sódio (SDS) </td><td> Bioshop </td><td> SDS001.500 </td><td></td></tr><tr><td> Uréia </td><td> Bioshop </td><td> URE001.5 </td><td></td></tr><tr><td> 40% Bis 29:1 / acrilamida </td><td> Bio Básico Inc. </td><td> A0007-500ml </td><td> Armazenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> Ácido bórico </td><td> EMD </td><td> BX0865-1 </td><td></td></tr><tr><td> Xileno cianol FF </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0423 </td><td></td></tr><tr><td> Azul de bromofenol </td><td> Bioshop </td><td> BR0222 </td><td></td></tr><tr><td> Sistema de Gel dupla ajustável Vertical </td><td> CBC Scientific Company Inc. </td><td> DASG-250 </td><td></td></tr><tr><td> Tela de cristalização índice </td><td> Hampton Research </td><td> HR2-144 </td><td> Armazenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> Assistente de tela cristalização I </td><td> Esmeralda BioSystems </td><td> EBS WIZ-1 </td><td> Armazenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> Assistente de tela cristalização II </td><td&gt; Emerald BioSystems </td><td> EBS WIZ-2 </td><td> Armazenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> Clássicos tela cristalização </td><td> Qiagen </td><td> 130701 </td><td> Armazenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> Bandejas Intelliplate </td><td> Arte Robbins Instruments </td><td> 102-0001-00 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Soluções Tampão de purificação de proteína: 100 mM de TRIS, pH 8, EDTA 2 mM, DTT 2 mM e glicerol a 5%. Tampão de proteínas de armazenamento: Tris 20 mM pH 8, NaCl 150 mM, DTT 5 mM, EDTA 0,5 mM e glicerol a 5%. Gel mistura de carga: Adicionam-se 20 g de sacarose, 25 mg de azul de bromofenol, 25 mg de xileno cianol FF, 1 ml de 10% w / v de SDS e 10 ml de TBE 10X e 70 ml de DDQ autoclavado 2 O. Agita-se com aquecimento suave até que a sacarose é dissolvido e ajustar a finalo volume a 100 ml com autoclavado DDH 2 O. Armazenar a 4 ° C. 2X tampão de carregamento: Adicionar 11 g de ureia em 10 ml de mistura de carregamento de gel. Agita-se sobre uma placa quente até que a ureia dissolve-se. Alíquota em tubos de 2 ml e armazenar a 4 ° C. Mistura PAGE 10X: Misturar 420,4 g de ureia, 100 ml de TBE 10X (autoclavada), 250 ml de 40% de 29:1 Bis / Acrilamida em DDH 2 O. Agitar até totalmente dissolvido e ajustar o volume para 1 litro. Armazenar em frascos escuros a 4 ° C. TBE 10X: Dissolver 108 g de TRIS, 55 g de ácido bórico e 9,3 g de EDTA em 1 litro de DDH 2 O. Autoclave e armazenar à temperatura ambiente. Tampão de eluição: Diluir 8 ml de NaCl 5 M, 2 mL de 1 M de Tris pH 7,5, 0,4 ml de EDTA 0,5 M pH 8 em 200 ml de DDQ 2 O. Autoclave e armazenar à temperatura ambiente. </td></tr></tbody></table&gt;

iterative optimization of dna duplexes for crystallization of seqa-dna complexes

Escherichia coli SEQA é um regulador negativo da replicação de ADN que impede eventos reinício prematuras por sequestrantes hemimethylated GATC aglomerados dentro da origem de replicação 1. Para além da origem, SEQA é encontrado nos garfos de replicação, onde organiza DNA recentemente replicado em maiores estruturas ordenadas 2. SEQA associados apenas fracamente com únicas seqüências GATC, mas forma complexos de alta afinidade com duplex de DNA contendo vários sites GATC. A unidade estrutural e funcional mínimo de SEQA é um dímero, explicando assim a exigência de pelo menos duas sequências GATC, para formar um complexo de alta afinidade com o DNA hemimethylated 3. Além disso, a arquitectura SEQA, com a oligomerização de ligação de ADN e domínios separados por um ligante flexível, permite a ligação de repetições GATC separados por até três voltas helicoidais. Portanto, a compreensão da função de SEQA em um nível molecular requer a ana estruturallise de SEQA ligada a várias sequências GATC. Na cristalização da proteína-DNA, o DNA pode ter nenhum efeito para uma excepcional sobre as interacções de embalagem, dependendo dos tamanhos relativos e da arquitectura da proteína e DNA. Se a proteína é maior do que o DNA ou pegadas maioria do DNA, o empacotamento cristalino é primariamente mediada por interacções proteína-proteína. Por outro lado, quando a proteína é do mesmo tamanho ou menor do que o DNA ou que abrange apenas uma fracção das interacções de DNA, DNA-DNA e DNA-proteína dominar empacotamento cristalino. Por conseguinte, a cristalização do DNA-proteína complexos requer o rastreio sistemático de 4 ADN de comprimento e as extremidades de ADN (sem corte ou saliência) 5-7. Neste relatório, nós descrevemos como projetar, otimizar, purificar e cristalizar duplex de DNA hemimethylated contendo repetições em tandem GATC em complexo com uma variante dimérica SEQA (SeqAΔ (41-59)-A25R) para obter cristais adequados para a determinação da estrutura.

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Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

Estrutura cristalina de complexos DNA-proteína pode fornecer informações sobre a função da proteína, mecanismo, assim como, a natureza da interacção específica. Aqui, nós relatamos como otimizar o comprimento, a sequência e as extremidades do DNA duplex para co-cristalização com<em&gt; Escherichia coli</em&gt; SEQA, um regulador negativo da iniciação da replicação.

Iterativo Otimização de Duplexos de DNA para Cristalização de SEQA-Complexos de DNA

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

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