Name: iterative optimization of dna duplexes for crystallization of seqa-dna complexes
Uploaded: 2012-11-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes at JoVE.com

Авторы выражают благодарность сотрудникам PXRR NSLS (Brookhaven National Laboratory) за помощь в сборе данных и Моника Pillon за помощь очистки ДНК. Эта работа была поддержана канадского института исследований в области здравоохранения (MOP 67189).

1. Очистки белков Гибкий линкер подключения N-(олигомеризации) и C-терминал (связывание ДНК) областях SeqA средствами признание hemimethylated GATC повторяет отделена от одного до трех поворотов на ДНК. Для этого исследования мы использовали димерный вариант SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) с точечной...

<ol>
	<li>Campbell, J. L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+oriC+and+the+dnaA+gene+promoter+are+sequestered+from+dam+methyltransferase+following+the+passage+of+the+chromosomal+replication+fork.">E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork.</a> Cell. 62, 967-979 (1990).</li><li>Guarn&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+SeqA-N+filament:+implications+for+DNA+replication+and+chromosome+organization.">Crystal structure of a SeqA-N filament: implications for DNA replication and chromosome organization.</a> Embo. J. 24, 1502-1511 (2005).</li><li>Brendler, T., Austin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+SeqA+protein+to+DNA+requires+interaction+between+two+or+more+complexes+bound+to+separate+hemimethylated+GATC+sequences.">Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences.</a> Embo. J. 18, 2304-2310 (1999).</li><li>Jordan, S. R., Whitcombe, T. V., Berg, J. M., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+variation+in+DNA+length+yields+highly+ordered+repressor-operator+cocrystals.">Systematic variation in DNA length yields highly ordered repressor-operator cocrystals.</a> Science. 230, 1383-1385 (1985).</li><li>Tan, S., Hunziker, Y., Pellegrini, L., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+the+yeast+MATalpha2/MCM1/DNA+ternary+complex:+general+methods+and+principles+for+protein/DNA+cocrystallization.">Crystallization of the yeast MATalpha2/MCM1/DNA ternary complex: general methods and principles for protein/DNA cocrystallization.</a> J. Mol. Biol. 297, 947-959 (2000).</li><li>Rice, P. A., Yang, S., Mizuuchi, K., Nash, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+IHF-DNA+complex:+a+protein-induced+DNA+U-turn.">Crystal structure of an IHF-DNA complex: a protein-induced DNA U-turn.</a> Cell. 87, 1295-1306 (1996).</li><li>Yang, W., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+site-specific+recombinase+gamma+delta+resolvase+complexed+with+a+34+bp+cleavage+site.">Crystal structure of the site-specific recombinase gamma delta resolvase complexed with a 34 bp cleavage site.</a> Cell. 82, 193-207 (1995).</li><li>Chung, Y. S., Brendler, T., Austin, S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+cooperative+binding+of+SeqA+to+a+tandem+GATC+repeat.">Structural insights into the cooperative binding of SeqA to a tandem GATC repeat.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li><li>Anderson, J., Ptashne, M., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocrystals+of+the+DNA-binding+domain+of+phage+434+repressor+and+a+synthetic+phage+434+operator.">Cocrystals of the DNA-binding domain of phage 434 repressor and a synthetic phage 434 operator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1307-1311 (1984).</li><li>Timsit, Y., Moras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+self-fitting:+the+double+helix+directs+the+geometry+of+its+supramolecular+assembly.">DNA self-fitting: the double helix directs the geometry of its supramolecular assembly.</a> Embo J. 13, 2737-2746 (1994).</li><li>Chung, Y. S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+SeqA+bound+to+a+pair+of+hemimethylated+GATC+sites.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of SeqA bound to a pair of hemimethylated GATC sites.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 64, 567-571 (2008).</li><li>DeLano, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphic Systems. , (2002).</li></ol>

Одна из самых больших проблем в макромолекулярных рентгеновской кристаллографии является получение кристаллов дифракция качества. В случае белок или белок-ДНК комплексов, эта задача осложняется из-за дополнительных переменных, которые должны быть оптимизированы. Широко распростран...

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Catalogue # </td><td> Комментарии (по желанию) </td></tr><tr><td> TRIS </td><td> Bioshop </td><td> TRS003.5 </td><td></td></tr><tr><td> Этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) </td><td> Fisher Scientific </td><td> E478-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiotheitrol (DTT) </td><td> Bio Basic Инк </td><td> DB0058 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Bioshop </td><td> SOD002.10 </td><td></td></tr><tr><td> Глицерин </td><td> Caledon </td><td> 5350-1 </td><td></td></tr><tr><td> Сахароза </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5016-500G </td><td></td></tr><tr><td> Додецилсульфата натрия (SDS) </td><td> Bioshop </td><td> SDS001.500 </td><td></td></tr><tr><td> Мочевина </td><td> Bioshop </td><td> URE001.5 </td><td></td></tr><tr><td> 40% 29:1 Bis / акриламида </td><td> Bio Basic Инк </td><td> A0007-500мл </td><td> Хранить при температуре 4 ° C </td></tr><tr><td> Борная кислота </td><td> EMD </td><td> BX0865-1 </td><td></td></tr><tr><td> Ксилол cyanol FF </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0423 </td><td></td></tr><tr><td> Bromophenol синий </td><td> Bioshop </td><td> BR0222 </td><td></td></tr><tr><td> Двойной регулируемый Вертикальная система Gel </td><td> CBC Научно Компания Инк </td><td> Препарат-250 </td><td></td></tr><tr><td> Экран Индекс кристаллизации </td><td> Hampton исследований </td><td> HR2-144 </td><td> Хранить при температуре 4 ° C </td></tr><tr><td> Мастер I кристаллизации экран </td><td> Emerald BioSystems </td><td> EBS-Wiz-1 </td><td> Хранить при температуре 4 ° C </td></tr><tr><td> Мастер II кристаллизации экран </td><td&gt; Emerald BioSystems </td><td> EBS-Wiz-2 </td><td> Хранить при температуре 4 ° C </td></tr><tr><td> Классика кристаллизации экран </td><td> Qiagen </td><td> 130701 </td><td> Хранить при температуре 4 ° C </td></tr><tr><td> Intelliplate лотков </td><td> Искусство Robbins Instruments </td><td> 102-0001-00 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Решения Белки очистки буфера: 100 мМ Трис, рН 8, 2 мМ ЭДТА, 2 мМ DTT и 5% глицерина. Белки хранения буфер: 20 мМ Трис рН 8, 150 мМ NaCl, 5 мМ ДТТ, 0,5 мМ ЭДТА и 5% глицерина. Гель для загрузки смеси добавить 20 г сахара, 25 мг бромфеноловый синий, 25 мг ксилола cyanol FF, 1 мл 10% в / SDS и 10 мл 10X TBE до 70 мл автоклавного DDH 2 O. Перемешать с легкой нагревание до сахарозы растворяют и отрегулировать окончательноеобъем до 100 мл автоклавного DDH 2 O. Хранить при температуре 4 ° C. 2X буфером загрузки: добавить 11 г мочевины на 10 мл геля смесь нагрузки. Движение на горячей плите, пока мочевина растворяется. Алиготе в 2 мл пробирки и хранят при 4 ° C. 10X смесь PAGE: Mix 420,4 г мочевины, 100 мл 10X TBE (автоклавного), 250 мл 40%-бис 29:1 / акриламида в DDH 2 O. Перемешать, пока полностью растворяется и регулировать громкость до 1 литра. Хранить в темной бутылке при температуре 4 ° C. 10X КЭ: Растворите 108 г Трис, 55 г борной кислоты и 9,3 г ЭДТА в 1 литре DDH 2 O. Автоклав и хранить при комнатной температуре. Элюции буфером: развести 8 мл 5 М NaCl, 2 мл 1 М Трис, рН 7,5, 0,4 мл 0,5 М ЭДТА рН 8 на 200 мл DDH 2 O. Автоклав и хранить при комнатной температуре. </td></tr></tbody></tabЛе&gt;

iterative optimization of dna duplexes for crystallization of seqa-dna complexes

Кишечная палочка SeqA является негативным регулятором репликации ДНК, что предотвращает преждевременное возобновление событий изолирующих hemimethylated GATC кластеров в начало репликации 1. Помимо происхождения, SeqA находится на репликацию вилки, где он организует новореплицированные ДНК в более упорядоченной структуры 2. SeqA ассоциируется только с одним слабо GATC последовательностей, но он образует комплексы высокого сходства с ДНК-дуплексов, содержащих несколько GATC сайтов. Минимальные функциональные и структурные единицы SeqA представляет собой димер, тем самым объясняя требование по крайней мере два GATC последовательности, чтобы сформировать высоким сродством комплексе с ДНК hemimethylated 3. Кроме того, архитектура SeqA, с олигомеризации и ДНК-связывающих доменов, разделенных гибкий линкер, позволяющий привязки к GATC повторов, разделенных до трех винтовых поворотов. Таким образом, понимание функции SeqA на молекулярном уровне требует структурного Anaлизис SeqA связан с несколькими GATC последовательности. В белок-ДНК кристаллизации, ДНК может иметь никто не исключительный эффект на упаковке взаимодействий в зависимости от относительных размеров и архитектуры белков и ДНК. Если белка больше, чем ДНК или отпечатки большая часть ДНК, кристаллической упаковки в первую очередь опосредовано белок-белковых взаимодействий. И наоборот, когда белка такое же или меньшего размера, чем ДНК или она покрывает лишь часть ДНК, ДНК-ДНК и ДНК-белковых взаимодействий доминировать кристаллической упаковки. Таким образом, кристаллизация белок-ДНК комплексов требует систематического скрининга ДНК 4 длины и ДНК концами (тупым или навес) 5-7. В этом докладе мы опишем, как разрабатывать, оптимизировать, очистить и кристаллизуются hemimethylated дуплексов ДНК, содержащий тандем GATC повторяется в комплексе с димерный вариант SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R), чтобы получить кристаллы подходят для определения структуры.

Watch this Scientific Journal Video about Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes at JoVE.com

Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

Кристаллическая структура белка-ДНК может дать представление о функции белка, механизма, а также, характера конкретного взаимодействия. Здесь мы сообщаем о том, как оптимизировать длину, последовательность и концы ДНК-дуплекса для совместной кристаллизации с<em&gt; Кишечной палочки</em&gt; SeqA, негативный регулятор инициации репликации.

Итерационные Оптимизация дуплексов ДНК для кристаллизации SeqA ДНК-комплексов

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

Research

JoVE Journal

Biology

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Кристаллизации белков для рентгеновской кристаллографии

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Кристаллизация Мембранные белки в липидных Мезофазы

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Высокая пропускная способность кристаллизации мембранных белков, используя метод липидный Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Использование робота для высокой пропускной кристаллизации мембранных белков в липидный Мезофазы

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Оптимизация и использование<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Опосредованного переходных Белок Производство в<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

АСМ на основе карт из упругих свойств клеточных стенок: на ткани, клеточном, и субклеточных резолюций

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

В режиме реального времени изображений Единого Engineered РНК-транскриптов в живых клетках, используя Логометрический Бимолекулярные маяки

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Генерация и очистка человека INO80 хроматина комплексов и подкомплексов

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Эффективное млекопитающих выражение клеток и Пошаговый Очистка внеклеточной гликопротеинов для кристаллизации

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

ДНК Электропорация, Изоляция и изображений из мышечных волокон

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...