Name: iterative optimization of dna duplexes for crystallization of seqa-dna complexes
Uploaded: 2012-11-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes at JoVE.com

Författarna vill tacka PXRR personalen på NSLS (Brookhaven National Laboratory) för hjälp vid insamling av data och Monica Pillon för hjälp med DNA-rening. Detta arbete stöddes av den kanadensiska Institutes of Health Research (MOP 67.189).

1. Proteinrening Den flexibla linker ansluter N-(oligomerisering) och C-terminal (DNA-bindande) domäner SeqA hjälpmedel erkännande av hemimetylerat GATC upprepningar åtskilda av 1-3 varv på DNA. För denna studie använde vi ett dimert variant av SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) med en punktmutation i den N-terminala domänen som förhindrar ytterligare oligomerisering och en förkortad linker som begränsar DNA-bindning till tandem upprepar GATC separerade enbart av ett varv på DNA (f...

<ol>
	<li>Campbell, J. L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+oriC+and+the+dnaA+gene+promoter+are+sequestered+from+dam+methyltransferase+following+the+passage+of+the+chromosomal+replication+fork.">E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork.</a> Cell. 62, 967-979 (1990).</li><li>Guarn&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+SeqA-N+filament:+implications+for+DNA+replication+and+chromosome+organization.">Crystal structure of a SeqA-N filament: implications for DNA replication and chromosome organization.</a> Embo. J. 24, 1502-1511 (2005).</li><li>Brendler, T., Austin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+SeqA+protein+to+DNA+requires+interaction+between+two+or+more+complexes+bound+to+separate+hemimethylated+GATC+sequences.">Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences.</a> Embo. J. 18, 2304-2310 (1999).</li><li>Jordan, S. R., Whitcombe, T. V., Berg, J. M., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+variation+in+DNA+length+yields+highly+ordered+repressor-operator+cocrystals.">Systematic variation in DNA length yields highly ordered repressor-operator cocrystals.</a> Science. 230, 1383-1385 (1985).</li><li>Tan, S., Hunziker, Y., Pellegrini, L., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+the+yeast+MATalpha2/MCM1/DNA+ternary+complex:+general+methods+and+principles+for+protein/DNA+cocrystallization.">Crystallization of the yeast MATalpha2/MCM1/DNA ternary complex: general methods and principles for protein/DNA cocrystallization.</a> J. Mol. Biol. 297, 947-959 (2000).</li><li>Rice, P. A., Yang, S., Mizuuchi, K., Nash, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+IHF-DNA+complex:+a+protein-induced+DNA+U-turn.">Crystal structure of an IHF-DNA complex: a protein-induced DNA U-turn.</a> Cell. 87, 1295-1306 (1996).</li><li>Yang, W., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+site-specific+recombinase+gamma+delta+resolvase+complexed+with+a+34+bp+cleavage+site.">Crystal structure of the site-specific recombinase gamma delta resolvase complexed with a 34 bp cleavage site.</a> Cell. 82, 193-207 (1995).</li><li>Chung, Y. S., Brendler, T., Austin, S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+cooperative+binding+of+SeqA+to+a+tandem+GATC+repeat.">Structural insights into the cooperative binding of SeqA to a tandem GATC repeat.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li><li>Anderson, J., Ptashne, M., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocrystals+of+the+DNA-binding+domain+of+phage+434+repressor+and+a+synthetic+phage+434+operator.">Cocrystals of the DNA-binding domain of phage 434 repressor and a synthetic phage 434 operator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1307-1311 (1984).</li><li>Timsit, Y., Moras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+self-fitting:+the+double+helix+directs+the+geometry+of+its+supramolecular+assembly.">DNA self-fitting: the double helix directs the geometry of its supramolecular assembly.</a> Embo J. 13, 2737-2746 (1994).</li><li>Chung, Y. S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+SeqA+bound+to+a+pair+of+hemimethylated+GATC+sites.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of SeqA bound to a pair of hemimethylated GATC sites.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 64, 567-571 (2008).</li><li>DeLano, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphic Systems. , (2002).</li></ol>

En av de största utmaningarna i makromolekylär röntgenkristallografi är att få kristaller diffraktion kvalitet. I fallet med protein eller protein-DNA-komplex, är denna utmaning förvärras på grund av de ytterligare variabler som måste optimeras. Det anses allmänt att längden av DNA och närvaron av klibbiga överhäng för att öka associationen av angränsande DNA-molekyler i en längre pseudo-duplex är de viktigaste parametrarna för att optimera. Emellertid, har vi visat att naturen och längden på dess...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Catalogue # </td><td> Kommentarer (tillval) </td></tr><tr><td> TRIS </td><td> Bioshop </td><td> TRS003.5 </td><td></td></tr><tr><td> Etylendiamintetraättiksyra (EDTA) </td><td> Fisher Scientific </td><td> E478-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiotheitrol (DTT) </td><td> Bio Basic Inc. </td><td> DB0058 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Bioshop </td><td> SOD002.10 </td><td></td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Caledon </td><td> 5350-1 </td><td></td></tr><tr><td> Sackaros </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5016-500G </td><td></td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfat (SDS) </td><td> Bioshop </td><td> SDS001.500 </td><td></td></tr><tr><td> Urea </td><td> Bioshop </td><td> URE001.5 </td><td></td></tr><tr><td> 40% 29:1 bis / akrylamid </td><td> Bio Basic Inc. </td><td> A0007-500ml </td><td> Förvaras vid 4 ° C </td></tr><tr><td> Borsyra </td><td> EMD </td><td> BX0865-1 </td><td></td></tr><tr><td> Xylencyanol FF </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0423 </td><td></td></tr><tr><td> Bromfenolblått </td><td> Bioshop </td><td> BR0222 </td><td></td></tr><tr><td> Dubbla Justerbar Vertikal gelsystem </td><td> CBC Scientific Company Inc </td><td> DASG-250 </td><td></td></tr><tr><td> Index kristallisering skärm </td><td> Hampton Research </td><td> HR2-144 </td><td> Förvaras vid 4 ° C </td></tr><tr><td> Guiden I kristallisering skärm </td><td> Smaragd BioSystems </td><td> EBS-WIZ-1 </td><td> Förvaras vid 4 ° C </td></tr><tr><td> Wizard II kristallisering skärm </td><td&gt; Emerald BioSystems </td><td> EBS-WIZ-2 </td><td> Förvaras vid 4 ° C </td></tr><tr><td> Klassiker kristallisering skärm </td><td> Qiagen </td><td> 130.701 </td><td> Förvaras vid 4 ° C </td></tr><tr><td> Intelliplate brickor </td><td> Konst Robbins Instruments </td><td> 102-0001-00 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Lösningar Proteinrening buffert: 100 mM Tris pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT och 5% glycerol. Protein lagringsbuffert: 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0,5 mM EDTA och 5% glycerol. Gel loading mix: Tillsätt 20 g sackaros, 25 mg bromfenolblått, 25 mg xylencyanol FF, 1 ml av 10% vikt / volym SDS och 10 ml 10X TBE till 70 ml autoklaverad DDH 2 O. Rör med mild upphettning tills sackaros är upplöst och justera den slutligavolym till 100 ml med autoklaverat DDH 2 O. Förvaras vid 4 ° C. 2X laddningsbuffert: Lägg 11 g karbamid till 10 ml gel lastning blandning. Rör på en het platta tills urea upplöses. Delprov i 2 ml rör och förvara vid 4 ° C. 10X SIDA mix: Blanda 420,4 g urea, 100 ml 10X TBE (autoklaverad), 250 ml 40% 29:1 Bis / Akrylamid i DDH 2 O. Rör tills helt upplöst och justera volymen till 1 liter. Förvara i mörka flaskor vid 4 ° C. 10X TBE: Lös 108 g TRIS, 55 g borsyra och 9,3 g EDTA i 1 liter av Ddh 2 O. Autoklav och förvara i rumstemperatur. Elueringsbuffert: Späd 8 ml 5 M NaCl, 2 ml av 1 M Tris pH 7,5, 0,4 ml 0,5 M EDTA pH 8 om 200 ml DDH 2 O. Autoklav och förvara i rumstemperatur. </td></tr></tbody></table&gt;

iterative optimization of dna duplexes for crystallization of seqa-dna complexes

Escherichia coli SeqA är en negativ regulator av DNA-replikation som förhindrar för tidig förnyad initiering händelser genom att binda hemimetylerat GATC kluster inom replikationsursprung 1. Bortom ursprung, SeqA finns vid replikationsgafflar, där det anordnar nyligen replikerade DNA i högre beställda strukturer 2. SeqA associerar endast svagt med enstaka GATC-sekvenser, men den bildar hög affinitet komplex med DNA-duplexar som innehåller flera GATC platser. Den minimala funktionella och strukturella enheten av SeqA är en dimer, vilket förklarar kravet av minst två GATC-sekvenser för att bilda en hög affinitet komplex med hemimetylerat DNA 3. Dessutom tillåter SeqA arkitektur, med oligomerisering och DNA-bindande domänerna separerade av en flexibel linker, bindning till GATC upprepningar separerade med upp till tre spiralformade varv. Därför att förstå funktionen av SeqA på molekylär nivå kräver strukturella analys av SeqA bundet till flera GATC-sekvenser. I protein-DNA-kristallisering kan DNA har ingen en exceptionell effekt på förpackning interaktioner beroende på de relativa storlek och arkitektur av proteinet och DNA. Om proteinet är större än DNA eller fotavtryck flesta av DNA, är kristallen packningen primärt medieras av protein-protein-interaktioner. Omvänt, när proteinet är av samma storlek eller mindre än DNA eller det bara täcker en bråkdel av DNA, DNA-DNA och DNA-protein-interaktioner dominerar kristall packning. Därför kräver kristallisation av protein-DNA-komplex systematisk screening av DNA-längd 4 och slutar DNA (trubbig eller överhäng) 5-7. I denna rapport beskriver vi hur man designar, optimera, rena och kristallisera hemimetylerat DNA-duplex innehållande tandem GATC upprepningar i komplex med en dimer variant av SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) för att erhålla kristaller lämpliga för strukturbestämning.

Watch this Scientific Journal Video about Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes at JoVE.com

Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

Kristallstruktur av protein-DNA-komplex kan ge insikt i proteinfunktion, mekanism, liksom, arten av den specifika interaktionen. Här rapporterar vi hur du optimerar längden, sekvens och ändarna av duplex-DNA för samarbete kristallisation med<em&gt; Escherichia coli</em&gt; SeqA, en negativ regulator av replikering initiering.

Iterativ Optimering av DNA-duplex för Kristallisation av SeqA-DNA-komplex

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

Research

JoVE Journal

Biology

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Protein Kristallisering för röntgenkristallografi

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Kristallisering av membranproteiner i Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Hög genomströmning Kristallisering av membranproteiner Använda Lipidic Bicelle Metod

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Användning av en robot för hög kapacitet Kristallisering av membranproteiner i lipidisk mesofaser

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimering och Utnyttjande av<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Medierad Transient Protein Produktion i<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

AFM-baserad Kartläggning av de elastiska egenskaperna hos cellväggar: i Tissue, Cellulär och Subcellulära resolutioner

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Realtid avbildning av Single Engineered RNA transkript hos levande celler Använda Propportionell bimolekylär Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Generation och rening av mänskliga INO80 Chromatin Remodeling Komplex och subcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Effektiv Mammalian Cell Expression och Single-steg Rening av extracellulära glykoproteiner för kristallisation

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Elektroporation, isolering och avbildning av Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...