Name: iterative optimization of dna duplexes for crystallization of seqa-dna complexes
Uploaded: 2012-11-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes at JoVE.com

Yazarlar DNA saflaştırılması ile ilgili yardım için veri toplama ve Monica Pillon sırasında yardım için NSLS (Brookhaven Ulusal Laboratuvarı) da PXRR personel teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Sağlık Araştırması Kanada Enstitüleri (MOP 67189) tarafından desteklenmiştir.

1. Protein Saflaştırma Bağlayan esnek bağlayıcı N-(oligomerizasyonun) ve C-terminal (DNA bağlayıcı) SeqA yardımları DNA üzerinde 1-3 tur ayırarak hemimethylated GAİK tekrarlarının tanınması etki. Bu çalışma için, biz daha oligomerizasyonun ve tarafından özel olarak ayrılmış tandem GAİK için bağlayıcı DNA tekrarlar kısıtlayan kısaltılmış bir bağlayıcı engeller N-terminal etki alanındaki bir nokta mutasyonu ile SeqA bir dimerik varyantı (SeqAΔ (41-59)-...

<ol>
	<li>Campbell, J. L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+oriC+and+the+dnaA+gene+promoter+are+sequestered+from+dam+methyltransferase+following+the+passage+of+the+chromosomal+replication+fork.">E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork.</a> Cell. 62, 967-979 (1990).</li><li>Guarn&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+SeqA-N+filament:+implications+for+DNA+replication+and+chromosome+organization.">Crystal structure of a SeqA-N filament: implications for DNA replication and chromosome organization.</a> Embo. J. 24, 1502-1511 (2005).</li><li>Brendler, T., Austin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+SeqA+protein+to+DNA+requires+interaction+between+two+or+more+complexes+bound+to+separate+hemimethylated+GATC+sequences.">Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences.</a> Embo. J. 18, 2304-2310 (1999).</li><li>Jordan, S. R., Whitcombe, T. V., Berg, J. M., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+variation+in+DNA+length+yields+highly+ordered+repressor-operator+cocrystals.">Systematic variation in DNA length yields highly ordered repressor-operator cocrystals.</a> Science. 230, 1383-1385 (1985).</li><li>Tan, S., Hunziker, Y., Pellegrini, L., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+the+yeast+MATalpha2/MCM1/DNA+ternary+complex:+general+methods+and+principles+for+protein/DNA+cocrystallization.">Crystallization of the yeast MATalpha2/MCM1/DNA ternary complex: general methods and principles for protein/DNA cocrystallization.</a> J. Mol. Biol. 297, 947-959 (2000).</li><li>Rice, P. A., Yang, S., Mizuuchi, K., Nash, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+IHF-DNA+complex:+a+protein-induced+DNA+U-turn.">Crystal structure of an IHF-DNA complex: a protein-induced DNA U-turn.</a> Cell. 87, 1295-1306 (1996).</li><li>Yang, W., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+site-specific+recombinase+gamma+delta+resolvase+complexed+with+a+34+bp+cleavage+site.">Crystal structure of the site-specific recombinase gamma delta resolvase complexed with a 34 bp cleavage site.</a> Cell. 82, 193-207 (1995).</li><li>Chung, Y. S., Brendler, T., Austin, S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+cooperative+binding+of+SeqA+to+a+tandem+GATC+repeat.">Structural insights into the cooperative binding of SeqA to a tandem GATC repeat.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li><li>Anderson, J., Ptashne, M., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocrystals+of+the+DNA-binding+domain+of+phage+434+repressor+and+a+synthetic+phage+434+operator.">Cocrystals of the DNA-binding domain of phage 434 repressor and a synthetic phage 434 operator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1307-1311 (1984).</li><li>Timsit, Y., Moras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+self-fitting:+the+double+helix+directs+the+geometry+of+its+supramolecular+assembly.">DNA self-fitting: the double helix directs the geometry of its supramolecular assembly.</a> Embo J. 13, 2737-2746 (1994).</li><li>Chung, Y. S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+SeqA+bound+to+a+pair+of+hemimethylated+GATC+sites.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of SeqA bound to a pair of hemimethylated GATC sites.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 64, 567-571 (2008).</li><li>DeLano, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphic Systems. , (2002).</li></ol>

Makromoleküler X-ışını kristalografisi en büyük zorluklardan biri difraksiyon kaliteli kristaller elde edilir. Protein veya protein-DNA kompleksleri halinde, bu sorun optimize edilmesi gerekmektedir ilave değişkenlere bağlı olarak daha da artmaktadır. Bu yaygın DNA uzunluğu ve yapışkan çıkıntılar varlığında daha uzun bir yarı-ana dubleks parametrelerini optimize etmek için olan komşu DNA moleküllerinin ilişki artırmak için düşünülmektedir. Bununla birlikte, bu çıkıntılar doğası ve...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog # </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> TRIS </td><td> Bioshop </td><td> TRS003.5 </td><td></td></tr><tr><td> Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) </td><td> Fisher Scientific </td><td> E478-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiotheitrol (DTT) </td><td> Bio Basic Inc </td><td> DB0058 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Bioshop </td><td> SOD002.10 </td><td></td></tr><tr><td> Gliserin </td><td> Caledon </td><td> 5350-1 </td><td></td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5016-500G </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum dodesil sülfat (SDS) </td><td> Bioshop </td><td> SDS001.500 </td><td></td></tr><tr><td> Üre </td><td> Bioshop </td><td> URE001.5 </td><td></td></tr><tr><td> 40% 29:1 Bis / akrilamit </td><td> Bio Basic Inc </td><td> A0007-500ml </td><td> 4 ° C&#39;de saklayın </td></tr><tr><td> Asit borik </td><td> EMD </td><td> BX0865-1 </td><td></td></tr><tr><td> Ksilen cyanol FF </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0423 </td><td></td></tr><tr><td> Bromophenol Mavi </td><td> Bioshop </td><td> BR0222 </td><td></td></tr><tr><td> Çift Ayarlanabilir Dikey Jel Sistemi </td><td> CBC Bilimsel Company Inc </td><td> DASG-250 </td><td></td></tr><tr><td> Endeks kristalizasyon ekranı </td><td> Hampton Araştırma </td><td> HR2-144 </td><td> 4 ° C&#39;de saklayın </td></tr><tr><td> Sihirbazı Ben kristalizasyon ekranı </td><td> Zümrüt BioSystems </td><td> EBS-WIZ-1 </td><td> 4 ° C&#39;de saklayın </td></tr><tr><td> Wizard II kristalizasyon ekranı </td><td&gt; Zümrüt BioSystems </td><td> EBS-WIZ-2 </td><td> 4 ° C&#39;de saklayın </td></tr><tr><td> Klasikler kristalizasyon ekranı </td><td> Qiagen </td><td> 130701 </td><td> 4 ° C&#39;de saklayın </td></tr><tr><td> Intelliplate tepsileri </td><td> Sanat Robbins Aletleri </td><td> 102-0001-00 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Çözümler Protein saflaştırma tamponu: 100 mM Tris pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT,% 5 gliserol. Protein saklama tamponu: 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0.5 mM EDTA,% 5 gliserol. Jel yükleme karışımı: otoklavlanmış GKD 2 O. 70 ml kadar sakaroz ve 20 g, bromofenol mavi 25 mg, ksilen cyanol FF 25 mg,% 10 w / v SDS, 1 ml ve 10X TBE 10 ml Sukroz eriyene kadar hafif ısıtma ile karıştırın ve nihai ayarlayınhacmi 100 otoklavlanmış GKD 2 O. ml 4 ° C&#39;de depolayın 2X yükleme tamponu: jel yükleme karışımı 10 ml üre, 11 g ekleyin. Üre eriyinceye kadar sıcak tabakta karıştırın. 4 az 2 ml tüpler ve mağaza kısım ° C. 10X PAGE karışımı: Karışım üre 420,4 g, 10X TBE 100 ml (otoklavlanmış),% 40, 250 ml 29:1 GKD 2 O. Bis / akrilamid Tamamen çözülene kadar karıştırın ve 1 litrelik hacim ayarlayın. 4 ° C&#39;de karanlıkta şişelerde saklayın 10X TBE: eritilir 108 g TRIS, GKD 2 O. 1 litre borik asit ve 55 g EDTA ve 9.3 g Otoklav oda sıcaklığında depolanır. Elüsyon tamponu: GKD 2 O. 200 ml 5 M NaCI, 1 M Tris, pH 7.5, 0.5 M EDTA, pH 8, 0,4 ml, 2 ml seyreltik 8 ml Otoklav oda sıcaklığında depolanır. </td></tr></tbody></table&gt;

iterative optimization of dna duplexes for crystallization of seqa-dna complexes

Escherichia coli SeqA çoğaltma 1 kökeni olan iyon hemimethylated GAİK kümelere göre prematüre reinitiation olayları önler DNA replikasyonunun negatif düzenleyicisidir. Kökeni ötesinde, SeqA çoğaltma çatal, daha yüksek sıralı yapılarına yeni çoğaltılmış DNA düzenlemektedir 2 de bulunur. SeqA ortakları yalnızca zayıf tek GAİK dizilerine sahip, ancak birden çok GAİK siteleri içeren DNA dubleksler yüksek afinite kompleksleri oluşturur. SeqA arasında en az işlevsel ve yapısal birim böylece hemimethylated DNA 3 ile yüksek afiniteli kompleks oluşumu için en az iki GAİK dizileri ihtiyacını açıklayan bir dimer. Ayrıca, oligomerizasyonun ve esnek bir bağlayıcı ile ayrılmış DNA-bağlayıcı etki ile SeqA mimarisi, üç helisel tur kadar ayrılmış GAİK tekrarlar için bağlayıcı sağlar. Bu nedenle, bir moleküler düzeyde SeqA fonksiyonu anlama yapısal ana gerektirirSeqA parçalanma birden GAİK dizileri bağlanmıştır. Protein-DNA kristalizasyon DNA, protein ve DNA göreceli boyutları ve mimariye bağlı olarak ambalaj etkileşimleri üzerinde olağanüstü bir etkisi yok olabilir. Protein veya DNA izleri, DNA&#39;nın çoğu daha büyük ise, kristal paketleme öncelikle protein-protein etkileşimleri aracılığı ile ortaya çıkmaktadır. Tersine, protein DNA ile aynı büyüklükte veya daha az olduğu veya sadece DNA, DNA-DNA, DNA-protein etkileşimlerinin bir kısmını kapsayan zaman kristal paketleme hakim. Bu nedenle, protein-DNA kompleksleri kristalleşme DNA uzunluğu 4 ile DNA uçları (küt çıkıntı veya) 5-7 sistematik olarak tarama gerektirir. Bu yazıda, tasarımı optimize, arındırmak ve yapı tayini için uygundur kristaller elde SeqA bir dimerik varyantı (SeqAΔ (41-59)-A25R) ile kompleks içinde tandem GAİK tekrarlar içeren hemimethylated DNA dubleksler kristalize nasıl açıklar.

Watch this Scientific Journal Video about Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes at JoVE.com

Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

Protein-DNA kompleksleri Kristal yapısı, protein işlevi, etki mekanizması, aynı zamanda, belirli bir etkileşimin doğasını ilişkin bilgi sağlayabilir. Burada ile birlikte kristalleşme için uzunluk, sekans ve dupleks DNA uçları optimize etmek için rapor<em&gt; Escherichia coli</em&gt; SeqA, çoğaltma inisiyasyon negatif regülatörü.

SeqA-DNA kompleksleri kristalleşmesi için DNA dupleksler optimizasyonu İteratif

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

Research

JoVE Journal

Biology

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

X-ray Kristalografi Protein Kristalizasyon

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Kristallendirilmesi

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Yüksek verim Kristalizasyon lipidik Bicelle Yöntemiyle Membran Proteinleri

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Yüksek throughput Kristalizasyon için bir robot kullanımı

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimizasyon ve Kullanımı<em&gt; Agrobacterium</emIn&gt; aracılı Geçici Protein Üretimi<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

Hücre Duvarları Elastik Özelliklerinin AFM-tabanlı Haritalama: doku, hücresel ve Subselüler Çözünürlüklerde

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Oranlı metrik Bimoleküler Fenerleri kullanma Yaşam Hücrelerde Tek Engineered RNA Transkriptlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Nesil ve İnsan INO80 Kromatin Yaptırma Kompleksleri ve subcomplexes saflaştırılması

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Verimli memeli hücre ekspresyon ve Kristalizasyon için hücre dışı Glikoproteinlerin Tek aşamalı saflaştırma

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Elektroporasyon, Myofibers İzolasyon ve Görüntüleme

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...