Name: generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the stemcca lentiviral vector
Uploaded: 2012-10-31T23:00:00
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Diese Studien wurden zum Teil durch NIH UO1HL107443-01 Award GJM und GM finanziert.

Ein. Isolation und Expansion von peripheren Blut mononukleären Zellen (PBMCs) DAY 0 <ol><li> Zeichnen 4 ml peripheres Blut in einen BD Vacutainer CPT Zellpräparation Tube mit Natriumcitrat. Das Röhrchen 8 bis 10 Mal und zentrifugieren bei 1.800 xg für 30 min bei Raumtemperatur. Idealerweise sollte dieser Schritt innerhalb von 2 h der Entnahme erfolgen. </li><li> Sammeln Sie die mononukleären Zellen (MCs) durch Pipettieren der Buffy-Coat (Zellschicht zwischen Gelbarriere und Plasma) in ei...

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	<li>Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+dermal+fibroblasts.">Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).</li><li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors.">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li><li>Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Stadtfeld, M., Hochedlinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotency:+history,+mechanisms,+and+applications.">Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications.</a> Genes Dev. 24, 2239-2263 (2010).</li><li>Somers, A., Jean, J. C., Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+transgene-free+lung+disease-specific+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+single+excisable+lentiviral+stem+cell+cassette.">Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette.</a> Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).</li><li>Loh, Y. H., Hartung, O., Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood.">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).</li><li>Seki, T., Yuasa, S., Oda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+terminally+differentiated+circulating+T+cells.">Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).</li><li>Staerk, J., Dawlaty, M. M., Gao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells.">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).</li><li>Chou, B. K., Mali, P., Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+human+iPS+cell+derivation+by+a+non-integrating+plasmid+from+blood+cells+with+unique+epigenetic+and+gene+expression+signatures.">Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures.</a> Cell Res. 21, 518-529 (2011).</li><li>vanden Akker, E., Satchwell, T. J., Pellegrin, S., Daniels, G., Toye, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+majority+of+the+in+vitro+erythroid+expansion+potential+resides+in+CD34(-)+cells,+outweighing+the+contribution+of+CD34(+)+cells+and+significantly+increasing+the+erythroblast+yield+from+peripheral+blood+samples.">The majority of the in vitro erythroid expansion potential resides in CD34(-) cells, outweighing the contribution of CD34(+) cells and significantly increasing the erythroblast yield from peripheral blood samples.</a> Haematologica. 95, 1594-1598 (2010).</li></ol>

Wir beschreiben hier die Verwendung des STEMCCA Lentivirusvektor die menschliche IPSCs aus mononukleären Zellen von einigen ml frisch gesammelten peripheren Blut isoliert erzeugen. Das Protokoll kann auch verwendet werden, um gefrorene PBMCs (direkt aus dem Buffy-Coat) erhalten ein Detail erhebliche praktische Auswirkungen umzuprogrammieren bei der Nutzung Spenderzellen von einem entfernten Standort erworben werden. Vor der Induktion von Umprogrammierung muss isolierten PBMCs durchlaufen eine kritische Expansionsstufe,...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube mit Natriumcitrat </td><td> BD Biosciences </td><td> 362760 </td><td></td></tr><tr><td> QBSF-60 Stem Cell Medium </td><td> Quality Biological </td><td> 160-204-101 </td><td></td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Invitrogen </td><td> 12440 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11330 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S10250 </td><td></td></tr><tr><td> Knockout Serum Replacement </td><td> Invitrogen </td><td> 10828 </td><td></td></tr><tr><td> Primocin </td><td> Invivogen </td><td> ant-pm-2 </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Non-Essential Amino Acids </td><td> Invitrogen </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> MP Biomedicals </td><td> 190242 </td><td></td></tr><tr><td> Ascorbinsäure </td><td> Sigma </td><td> A4544 </td><td></td></tr><tr><td> IGF-1 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 291-G1 </td><td></td></tr><tr><td> IL-3 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 203-IL </td><td></td></tr><tr><td> SCF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 255-SC </td><td></td></tr><tr><td> EPO </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 286-EP </td><td></td></tr><tr><td> Dexamethasone </td><td> Sigma </td><td> D4902 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> Sigma </td><td> H-9268 </td><td></td></tr><tr><td> bFGF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 233-FB </td><td></td></tr><tr><td> Stemolecule Y27632 </td><td> Stemgent </td><td> 04-0012 </td><td></td></tr><tr><td> ES Cell Marker Sample Kit </td><td> Millipore </td><td> SCR002 </td><td></td></tr></tbody></table>

generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the stemcca lentiviral vector

Durch die ektopische Expression von vier Transkriptionsfaktoren, Oct4, Klf4, Sox2 und cMyc können menschliche Körperzellen zu einer pluripotenten Zustand umgewandelt werden, erzeugen so genannte induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) 1-4. Patienten-spezifischen iPS fehlen die ethischen Bedenken, die embryonalen Stammzellen (ESC) umgeben und möglich wäre Immunabwehr zu umgehen. So haben iPSCs große Aufmerksamkeit für die Krankheit Modeling-Studien, das Screening von pharmakologischen Verbindungen und regenerative Therapien 5 angezogen. Wir haben die Erzeugung von Transgen-freien menschlichen iPS von Patienten mit unterschiedlichen Lungenerkrankungen mit einer einzigen verbrauchsteuerpflichtiger polycistronischen lentiviralen Stem Cell Kassette (STEMCCA) Codieren der Yamanaka Faktoren 6 gezeigt. Diese Linien wurden iPSC aus Hautfibroblasten, die häufigste Zelltyp zum Umprogrammieren verwendet erzeugt. Normalerweise erfordert ein Erhalten Fibroblasten Haut Stanzbiopsie gefolgt durch Expansion der Zelles in der Kultur für ein paar Passagen. Wichtigerweise haben eine Anzahl von Gruppen die Umprogrammierung von menschlichen peripheren Blutzellen in IPSCs 7-9 berichtet. In einer Studie wurde eine induzierbare Tet Version des STEMCCA Vektor 9 verwendet, welche erforderlich ist, um die Blutzellen gleichzeitig mit einem konstitutiv aktiven Lentivirus Codieren des Reverse Tetracyclin-Transaktivator-infiziert. Im Gegensatz zu Fibroblasten, kann peripheren Blutzellen mittels minimal-invasive Verfahren gesammelt werden, stark reduziert die Beschwerden und Leiden des Patienten. Eine einfache und effektive Protokoll zur Reprogrammierung Blutkörperchen Verwendung eines konstitutiven einzigen verbrauchsteuerpflichtiger Vektor kann die Anwendung von iPS-Technologie, indem sie Zugang zu einem breiteren Forschungsgemeinschaft beschleunigen. Darüber hinaus Umprogrammierung der Zellen des peripheren Blutes ermöglicht die Erzeugung von iPS von Einzelpersonen in der Hautbiopsien vermieden werden (dh. Aberrante Narbenbildung) oder sollten aufgrund bereits bestehenden Krankheitszuständen preventing Zugang zu Stanzbiopsien. Hier zeigen wir, ein Protokoll für die Herstellung von menschlichen IPSCs aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) unter Verwendung eines einzigen floxed-verbrauchsteuerpflichtigen Lentivirusvektor konstitutiv exprimieren die 4 Faktoren. Frisch gesammelten oder aufgetaute PBMCs werden für 9 Tage wie beschrieben in Medium enthaltenden 10,11 Ascorbinsäure, SCF, IGF-1, IL-3 und EPO bevor es mit dem STEMCCA Lentivirus transduziert erweitert. Die Zellen werden dann auf MEFs ausplattiert und ESC-ähnliche Kolonien visualisiert werden kann 2 Wochen nach der Infektion. Schließlich werden selektierten Klone expandiert und auf die Expression der Marker Pluripotenz SSEA-4, Tra-1-60 und Tra-1-81. Dieses Protokoll ist einfach, robust und sehr konsistente, eine zuverlässige Methode zur Herstellung von menschlichen IPSCs aus leicht zugänglichen 4 ml Blut.

Wir demonstrieren eine einfache und effektive Protokoll für die Herstellung von menschlichen IPSCs aus PBMCs unter Verwendung eines einzigen lentiviralen Vektor. 1A zeigt eine schematische Darstellung des Protokolls. Das Blut wird in einen BD Vacutainer CPT Zellpräparation Tube mit Natriumcitrat gesammelt, und nach Zentrifugation, mononukleären Zellen können von der Schnittstelle zwischen dem Polyester Gel und dem Plasma (buffy coat) (1B) gesammelt werden. Die isolierten PBMCs werde...

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Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Hier zeigen wir, ein einfaches und effektives Protokoll für die Herstellung von menschlichen IPSCs 3-4 ml peripheres Blut unter Verwendung eines einzigen lentiviralen Vektors Umprogrammierung. Reprogrammierung von leicht verfügbaren Blutkörperchen verspricht die Nutzung von iPS-Technologie, indem sie Zugang zu einem breiteren Forschungsgemeinschaft beschleunigen.

Generation of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit dem STEMCCA Lentivirusvektor

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen durch Reprogrammierung embryonalen Maus-Fibroblasten mit einem Vier Transcription Factor, induzierbare Doxycycline Lentivirale Transduktionssystems

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

Forschung

Biologie

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen durch Reprogrammierung menschlichen Fibroblasten mit dem Stemgent Menschliche TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentivirale-vermittelte Knockdown Während Ex Vivo Erythropoese von humanen hämatopoetischen Stammzellen

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Transfektion und Nucleofecting menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Selektieren und Isolieren Colonies of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus adulten Fibroblasten Umprogrammierte

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Reprogrammierung menschlichen Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) mit retroviralen Vektoren mit GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Schnelle und effiziente Erzeugung von Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem Multititre Platte Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Human Cardiomyocytes: Eine Differenzierung Protokoll von Feeder-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...