Name: assaying dna damage in hippocampal neurons using the comet assay
Uploaded: 2012-12-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par le prix IMPACT du Département de radio-oncologie de l&#39;Université d&#39;Alabama-Birmingham Comprehensive Cancer Center, la Fondation du cancer de l&#39;enfance de combat, et l&#39;Ange Gabrielle Fondation (à ESY.).

1. Culture cellulaire <ol><li> Cellules neuronales Culture et les traitent selon les besoins. </li><li> Récolte des cellules dans des tubes de 15 ml: médias aspirés, rincer avec du tampon phosphate salin (PBS, de calcium et de magnésium libre), ajouter la trypsine, la collecte en tubes de 15 ml et neutraliser la trypsine avec appropriées milieux contenant du sérum. </li><li> Centrifuger à 1000 xg pendant 5 min. </li><li> Aspirer les médias. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans du PBS. </li><li> C...

<ol>
	<li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay:+a+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells.">The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).</li><li>Hovhannisyan, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+in+combination+with+the+comet+assay+and+micronucleus+test+in+genetic+toxicology.">Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology.</a> Mol. Cytogenet. 3, (2010).</li><li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay.+An+overview+of+techniques.">The comet assay. An overview of techniques.</a> Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).</li><li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+DNA+damage+in+individual+cells+by+analysis+of+histone+H2AX+phosphorylation.">Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation.</a> Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).</li><li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+comet+assay+in+radiobiology.">Impact of the comet assay in radiobiology.</a> Mutat. Res. 681, 13-23 (2009).</li><li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+H2AX+phosphorylation+after+exposure+to+cisplatin.">Kinetics of H2AX phosphorylation after exposure to cisplatin.</a> Cytometry B Clin. Cytom. 76, 79-90 (2009).</li><li>Olive, P. L., Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+DNA+damage+using+the+comet+assay.">Heterogeneity in DNA damage using the comet assay.</a> Cytometry A. 66, 1-8 (2005).</li><li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair.">The comet assay for DNA damage and repair.</a> Molecular biotechnology. 26, 249-261 (2004).</li><li>Fairbairn, D. W., Olive, P. L., O'Neill, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay:+a+comprehensive+review.">The comet assay: a comprehensive review.</a> Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. 339, 37-59 (1995).</li><li>Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase+3B+inhibition+enhances+repair+of+DNA+double-strand+breaks+in+irradiated+hippocampal+neurons.">Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons.</a> Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).</li><li>Yang, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lithium-mediated+protection+of+hippocampal+cells+involves+enhancement+of+DNA-PK+dependent+repair+in+mice.">Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice.</a> The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).</li><li>Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+modulation+of+DNA+repair+in+a+human+intervention+study.">Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study.</a> Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).</li><li>Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hOGG1+recognizes+oxidative+damage+using+the+comet+assay+with+greater+specificity+than+FPG+or+ENDOIII.">hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII.</a> Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).</li><li>Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+8-oxoguanine+DNA+glycosylase.">Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).</li><li>Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+hOGG1,+a+human+homolog+of+the+OGG1+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).</li><li>Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+gammaH2AX+foci+as+an+indication+of+lethal+DNA+lesions.">Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions.</a> BMC Cancer. 10, 4 (2010).</li><li>Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+sensitivity,+H2AX+phosphorylation,+and+kinetics+of+repair+of+DNA+strand+breaks+in+irradiated+cervical+cancer+cell+lines.">Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines.</a> Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).</li><li>Bonner, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[gamma]H2AX+and+cancer.">[gamma]H2AX and cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 8, 957-967 (2008).</li><li>Finney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+Field+Gel+Electrophoresis.">Pulsed Field Gel Electrophoresis.</a> Current protocols in molecular biology. , (2000).</li><li>Electrophoresis, F. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pulsed-field gel electrophoresis. , (2000).</li><li>Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+poly+(ADP-Ribose)+polymerase+inhibitor+ABT-888+reduces+radiation-induced+nuclear+EGFR+and+augments+head+and+neck+tumor+response+to+radiotherapy.">The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy.</a> Radiotherapy and Oncology. , (2011).</li></ol>

Le test des comètes a la capacité unique d&#39;analyse de cellules individuelles. Ceci est avantageux pour l&#39;identification des sous-populations de cellules qui démontrent une réponse différentielle aux agents cytotoxiques. A quelques limitations pratiques doivent être prises en compte. Le nombre de cellules qui peuvent être évalués individuellement peuvent varier selon les individus. La taille de l&#39;échantillon doit être augmenté s&#39;il ya variation des dommages à l&#39;ADN dans une population. Vi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Tubes de 1,5 ml </td><td> Santa Cruz Biotechnology, Inc </td><td> Sc-200271 </td><td></td></tr><tr><td> 10X TBE (Tris base, l&#39;acide borique, de l&#39;EDTA) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP13331 </td><td></td></tr><tr><td> Tube de 15 ml </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0553851 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Sigma </td><td> A5093 </td><td></td></tr><tr><td> Le papier d&#39;aluminium </td><td> Fisher Scientific </td><td> 01213101 </td><td></td></tr><tr><td> Gobelet </td><td> Fisher Scientific </td><td> FB102300 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuger </td><td> Thermo Scientific </td><td> 75004261PR </td><td></td></tr><tr><td> Logiciel Comet Assay </td><td> Comet Assay IV Système d&#39;analyse d&#39;images </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cylindre </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08555F </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 15575 </td><td></td></tr><tr><td> Chambre d&#39;électrophorèse </td><td> Thermo Scientific </td><td> 09528101 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;éthanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A407P4 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope à fluorescence </td><td> Zeiss Axio Vision </td><td></td><td> Toute microscope à fluorescence avec un filtre vert suffira </td></tr><tr><td> Hémacytomètre </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0267152 </td><td></td></tr><tr><td> D&#39;agarose à faible point de fusion </td><td> Promega </td><td> V2111 </td><td></td></tr><tr><td> Micro-onde </td><td> Sears </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Saline tamponnée au phosphate, calcium libre, magnésium libre </td><td> HyClone </td><td> SH3025601 </td><td></td></tr><tr><td> Alimentation </td><td> BioRad </td><td> 1645050 </td><td></td></tr><tr><td> Réfrigérateur </td><td> Sears </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Règle </td><td> Staples </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glissement </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12550143 </td><td></td></tr><tr><td> De chlorure de sodium </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;hydroxyde de sodium </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Sodium lauryl sarcosinate </td><td> Fisher Scientific </td><td> S529 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green </td><td> Invitrogen </td><td> S7585 </td><td></td></tr><tr><td> Plateau </td><td> Fissa science </td><td> 15242B </td><td></td></tr><tr><td> Base de tris </td><td> Sigma </td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X 100 </td><td> Sigma </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine </td><td> HyClone </td><td> SH3023601 </td><td></td></tr><tr><td> Vortex </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02216108 </td><td></td></tr><tr><td> Bain d&#39;eau </td><td> Fisher Scientific </td><td> 154622Q </td><td></td></tr></tbody></table>

assaying dna damage in hippocampal neurons using the comet assay

Un certain nombre de médicaments ciblent les voies de réparation de l&#39;ADN et induire des cellules tuer en créant des lésions de l&#39;ADN. Ainsi, des procédés pour mesurer directement lésions de l&#39;ADN ont été largement évalués. Les méthodes traditionnelles sont longs, coûteux, et nécessitent beaucoup de ressources de réplication des cellules. En revanche, le test des comètes, un essai de cellule unique électrophorèse sur gel, est plus rapide, non invasif, peu coûteux, mesure directe et sensible de dommages à l&#39;ADN et la réparation. Toutes les formes de dommages à l&#39;ADN ainsi que réparation de l&#39;ADN peut être visualisé au niveau de la cellule unique à l&#39;aide de cette technique puissante. Le principe qui sous-tend le test des comètes est que l&#39;ADN intact est très ordonnée alors dommages à l&#39;ADN perturbe cette organisation. Les suintements d&#39;ADN endommagés dans la matrice d&#39;agarose et lorsqu&#39;il est soumis à un champ électrique, l&#39;ADN chargé négativement migre vers la cathode qui est chargée positivement. Les brins d&#39;ADN endommagés grands ne sont pas en mesure de migrer loin du noyau. Dommages à l&#39;ADNcrée des fragments d&#39;ADN plus petits qui voyagent plus loin que l&#39;ADN intact. Comet Assay, un logiciel d&#39;analyse d&#39;images, mesures et compare l&#39;intensité globale fluorescent de l&#39;ADN dans le noyau avec l&#39;ADN qui a migré hors du noyau. Signal fluorescent de l&#39;ADN migré est proportionnelle à endommager l&#39;ADN. ADN queue plus claire signifie lésions de l&#39;ADN accrue. Certains des paramètres qui sont mesurés sont actuellement queue qui est à la fois une mesure de la quantité d&#39;ADN et de la distribution de l&#39;ADN dans la queue de longueur de queue, et le pourcentage d&#39;ADN dans la queue. Ce test permet de mesurer réparation de l&#39;ADN ainsi car la résolution des lésions de l&#39;ADN signifie la réparation a eu lieu. La limite de sensibilité est d&#39;environ 50 cassures par 1,2 cellule diploïde mammalien. Les cellules traitées avec des agents endommageant l&#39;ADN, tels que l&#39;étoposide, peut être utilisé en tant que contrôle positif. Ainsi, le test des comètes est une procédure rapide et efficace pour mesurer dommages à l&#39;ADN.

Watch this Scientific Journal Video about Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay at JoVE.com

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Le test des comètes est un moyen efficace de détection de ruptures simple et double brin, y compris alcali-labiles sites et DNA-DNA/DNA-protein liens croisés sur l&#39;ADN dans toutes les cellules, y compris les neurones hippocampiques. La méthode tire parti de la migration différentielle de l&#39;ADN dans un champ électrique dû à des différences de quantité de dommages de l&#39;ADN.

Le dosage de dommages de l&#39;ADN dans les neurones hippocampiques Utilisation de l&#39;essai de comète

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucléofection et de la culture primaire de neurones embryonnaires de souris hippocampe et cortex

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Recherche

Neurosciences

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Neuromodulation et mitochondriale de transport: Live in Imaging neurones de l&#39;hippocampe sur des durées longues

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

L&#39;isolement et la culture de neurones de l&#39;hippocampe de souris pendant la grossesse

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Deux enregistrements électrophysiologiques des synapses-réponses évoquées astrogliales et neuronales aiguës dans des coupes d&#39;hippocampe

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Détection de la palmitoylation des protéines dans les neurones de l&#39;hippocampe en culture par immunoprécipitation et Acyl-biotine Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Phosphate de calcium transfection de primaire neurones de l&#39;hippocampe

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imagerie épines dendritiques des neurones de l&#39;hippocampe de rat primaire utilisant structuré Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence et bioluminescence imagerie des Subcellular Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; In Aged neurones de l&#39;hippocampe

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Stripe Assay pour étudier l&#39;activité attractive ou répulsive d&#39;un substrat protéique utilisant dissociées hippocampique Neurones

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Évaluation de la complexité dendritique de l&#39;hippocampe chez les souris vieillies utilisant la méthode de Golgi-Cox

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...