Name: assaying dna damage in hippocampal neurons using the comet assay
Uploaded: 2012-12-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der IMPACT Award vom Department of Radiation Oncology, University of Alabama-Birmingham Comprehensive Cancer Center, The Fighting Kinderkrebsstiftung und der Gabrielle &#39;s Angel Foundation (zum ESY.) Unterstützt.

Ein. Cell Culture <ol><li> Kultur neuronalen Zellen und behandeln Sie sie nach Bedarf. </li><li> Ernte Zellen in 15 ml Röhrchen: Aspirat Medien, mit Phosphat spülen Kochsalzlösung (PBS, Calcium und Magnesium befreit), fügen Trypsin, sammeln sich in 15 ml Röhrchen und neutralisieren Trypsin mit geeigneten serumhaltigen Medien. </li><li> Spin bei 1.000 xg für 5 min. </li><li> Absaugen Medien. </li><li> Die Zellen in PBS. </li><li> Spin bei 1.000 xg für 5 min. </li><li> Absaugen Medien und resuspendieren Zellen in...

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	<li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay:+a+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells.">The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).</li><li>Hovhannisyan, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+in+combination+with+the+comet+assay+and+micronucleus+test+in+genetic+toxicology.">Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology.</a> Mol. Cytogenet. 3, (2010).</li><li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay.+An+overview+of+techniques.">The comet assay. An overview of techniques.</a> Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).</li><li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+DNA+damage+in+individual+cells+by+analysis+of+histone+H2AX+phosphorylation.">Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation.</a> Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).</li><li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+comet+assay+in+radiobiology.">Impact of the comet assay in radiobiology.</a> Mutat. Res. 681, 13-23 (2009).</li><li>Olive, P. L., Banath, J. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lithium-mediated+protection+of+hippocampal+cells+involves+enhancement+of+DNA-PK+dependent+repair+in+mice.">Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice.</a> The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).</li><li>Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+modulation+of+DNA+repair+in+a+human+intervention+study.">Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study.</a> Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).</li><li>Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hOGG1+recognizes+oxidative+damage+using+the+comet+assay+with+greater+specificity+than+FPG+or+ENDOIII.">hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII.</a> Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).</li><li>Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+8-oxoguanine+DNA+glycosylase.">Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).</li><li>Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+hOGG1,+a+human+homolog+of+the+OGG1+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).</li><li>Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+gammaH2AX+foci+as+an+indication+of+lethal+DNA+lesions.">Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions.</a> BMC Cancer. 10, 4 (2010).</li><li>Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+sensitivity,+H2AX+phosphorylation,+and+kinetics+of+repair+of+DNA+strand+breaks+in+irradiated+cervical+cancer+cell+lines.">Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines.</a> Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).</li><li>Bonner, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[gamma]H2AX+and+cancer.">[gamma]H2AX and cancer.</a> Nat. Rev. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+poly+(ADP-Ribose)+polymerase+inhibitor+ABT-888+reduces+radiation-induced+nuclear+EGFR+and+augments+head+and+neck+tumor+response+to+radiotherapy.">The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy.</a> Radiotherapy and Oncology. , (2011).</li></ol>

Der Comet Assay hat die einzigartige Fähigkeit zur Analyse von einzelnen Zellen. Dies ist vorteilhaft bei der Identifizierung von Subpopulationen von Zellen, die differenzielle Reaktion auf zytotoxischen Mitteln demonstrieren. Einige praktische Einschränkungen zu berücksichtigen. Die Anzahl der Zellen, die einzeln ausgewertet werden kann je nach dem Individuum. Der Stichprobenumfang erhöht werden muss, wenn es Varianz in DNA-Schädigung innerhalb einer Population. Lebensfähigen Einzelzell-Suspension ist für diesen...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> 1,5 ml Röhrchen </td><td> Santa Cruz Biotechnology, Inc. </td><td> Sc-200.271 </td><td></td></tr><tr><td> 10X TBE (Tris-Base, Borsäure, EDTA) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP13331 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml Tube </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0553851 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Sigma </td><td> A5093 </td><td></td></tr><tr><td> Aluminiumfolie </td><td> Fisher Scientific </td><td> 01213101 </td><td></td></tr><tr><td> Becher </td><td> Fisher Scientific </td><td> FB102300 </td><td></td></tr><tr><td> Zentrifugieren </td><td> Thermo Scientific </td><td> 75004261PR </td><td></td></tr><tr><td> Comet Assay-Software </td><td> Comet Assay IV Image Analysis System </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zylinder </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08555F </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 15575 </td><td></td></tr><tr><td> Electrophoresis Kammer </td><td> Thermo Scientific </td><td> 09528101 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A407P4 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoreszenzmikroskop </td><td> Zeiss Axio Vision- </td><td></td><td> Jede Fluoreszenzmikroskop mit Grünfilter genügt </td></tr><tr><td> Hämazytometer </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0267152 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt </td><td> Promega </td><td> V2111 </td><td></td></tr><tr><td> Mikrowelle </td><td> Sears </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Phosphatgepufferter Kochsalzlösung, Calcium-freien, Magnesium kostenlos </td><td> HyClone </td><td> SH3025601 </td><td></td></tr><tr><td> Stromversorgung </td><td> BioRad </td><td> 1645050 </td><td></td></tr><tr><td> Kühlschrank </td><td> Sears </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Herrscher </td><td> Staples </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gleiten </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12550143 </td><td></td></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumhydroxid </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumlaurylsarcosinat </td><td> Fisher Scientific </td><td> S529 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green </td><td> Invitrogen </td><td> S7585 </td><td></td></tr><tr><td> Tablett </td><td> Fisihrem Scientific </td><td> 15242B </td><td></td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> Sigma </td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X 100 </td><td> Sigma </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> HyClone </td><td> SH3023601 </td><td></td></tr><tr><td> Wirbel </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02216108 </td><td></td></tr><tr><td> Wasserbad </td><td> Fisher Scientific </td><td> 154622Q </td><td></td></tr></tbody></table>

assaying dna damage in hippocampal neurons using the comet assay

Eine Reihe von Medikamenten gezielt die DNA Reparaturmechanismen und induzieren Zelle, indem sie DNA-Schäden zu töten. So wurden Prozesse direkt zu messen DNA-Schäden wurde ausgiebig evaluiert. Herkömmliche Methoden sind zeitaufwendig, teuer und erfordern ressourcenintensiv replizierende Zellen. Im Gegensatz dazu ist die Comet-Assay, eine einzelne Zelle Gelelektrophorese-Assay, ein schneller, nicht-invasiven, kostengünstigen, direkt und empfindliches Maß von DNA-Schäden und Reparatur. Alle Formen von DNA-Schäden sowie DNA-Reparatur kann an der einzelnen Zelle mit diesem leistungsstarken Technik visualisiert werden. Das Prinzip des Comet Assay ist, dass intakte DNA ist hoch geordnete wohingegen DNA Schädigung unterbricht diese Organisation. Die beschädigten DNA sickert in der Agarose-Matrix und, wenn sie einem elektrischen Feld ausgesetzt wird, wandert der negativ geladenen DNA zur Kathode, das positiv geladen ist. Die großen unbeschädigten DNA-Stränge sind nicht in der Lage zu weit vom Kern migrieren. DNA-Schädenentstehen kleinere DNA-Fragmente, die weiter als die intakte DNA reisen. Kometentest eine Bildanalyse-Software, misst und vergleicht die gesamte Fluoreszenzintensität der DNA im Zellkern mit DNA, die aus dem Nukleus migriert ist. Fluoreszenzsignal aus der migrierten DNA ist proportional zur DNA-Schäden. Längere heller DNA tail bedeutet erhöhte DNA-Schäden. Einige der Parameter, die gemessen werden Leitwerksmoment die ein Maß für sowohl der Menge an DNA und Verteilung der DNA im Schwanz, Schwanzlänge und Prozentsatz der DNA in dem Endstück ist. Dieser Test ermöglicht es, DNA-Reparatur als auch messen, da Auflösung von DNA-Schäden bezeichnet Reparatur stattgefunden hat. Die Grenze der Empfindlichkeit liegt bei etwa 50 Strangbrüche pro diploid Säugetierzellen 1,2. Zellen mit irgendwelchen DNA-schädigende Mittel, wie zum Beispiel Etoposid behandelt wird, kann als eine positive Kontrolle verwendet werden. So ist die Comet-Assay ist eine schnelle und wirksame Verfahren, um DNA-Schäden zu messen.

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Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Der Comet Assay ist ein effizientes Mittel zur Feststellung von Einzel-und Doppelstrang-Brüche, einschließlich Alkali-labile Websites und DNA-DNA/DNA-protein Cross-Links auf der DNA in allen Zellen, einschließlich Neuronen im Hippocampus. Die Methode nimmt den Vorteil dieser differentielle Migration von DNA in einem elektrischen Feld aufgrund von Unterschieden in Menge an DNA-Schäden.

Testen DNA Damage in Hippocampus-Neuronen mit dem Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection und Primärkultur von embryonalen Maus-Hippocampus und kortikalen Neuronen

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Neuromodulation und Mitochondriale Transport: Live Imaging in Hippocampus-Neuronen über lange Zeiträume

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Isolierung und Kultivierung von Neuronen im Hippocampus von Mäusen Pränatale

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Detektion von Protein Palmitoylierung in kultivierten Hippocampus-Neuronen durch Immunopräzipitation und Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calciumphosphat-Transfektion von primären Hippocampus-Neuronen

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imaging dendritischen Dornen von Rat Primär Hippocampus Neuronen mit Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluoreszenz- und Biolumineszenz-Bildgebung subzellulärer Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Im Alter von Neuronen im Hippocampus

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Stripe Assay die anziehende oder abstoßende Aktivität eines Proteins Substrat unter Verwendung Dissociated Neuronen im Hippocampus zu studieren

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Bewertung der Hippocampalen Dendritischen Komplexität bei gealterten Mäusen unter Verwendung der Golgi-Cox-Methode

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...