Name: assaying dna damage in hippocampal neurons using the comet assay
Uploaded: 2012-12-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay at JoVE.com

עבודה זו נתמכה בפרס IMPACT מהמחלקה לאונקולוגיה קרינה, אוניברסיטת אלבמה-בירמינגהם המקיף במרכז הסרטן, קרן הסרטן של לחימת הילדים, ואנג&#39;ל הקרן של גבריאל (לESY.) על ידי.

1. תא תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תרבות עצביים ולטפל בם כנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי קציר לתוך צינורות 15 מ&quot;ל: תקשורת לשאוב, לשטוף עם פוספט נאגרו מלוח (PBS, סידן ומגנזיום חינם), להוסיף טריפסין, לאסוף בצינורות 15 מ&quot;ל, ולנטרל את טרי...

<ol>
	<li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay:+a+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells.">The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).</li><li>Hovhannisyan, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+in+combination+with+the+comet+assay+and+micronucleus+test+in+genetic+toxicology.">Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology.</a> Mol. Cytogenet. 3, (2010).</li><li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay.+An+overview+of+techniques.">The comet assay. An overview of techniques.</a> Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).</li><li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+DNA+damage+in+individual+cells+by+analysis+of+histone+H2AX+phosphorylation.">Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation.</a> Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).</li><li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+comet+assay+in+radiobiology.">Impact of the comet assay in radiobiology.</a> Mutat. Res. 681, 13-23 (2009).</li><li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+H2AX+phosphorylation+after+exposure+to+cisplatin.">Kinetics of H2AX phosphorylation after exposure to cisplatin.</a> Cytometry B Clin. Cytom. 76, 79-90 (2009).</li><li>Olive, P. L., Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+DNA+damage+using+the+comet+assay.">Heterogeneity in DNA damage using the comet assay.</a> Cytometry A. 66, 1-8 (2005).</li><li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair.">The comet assay for DNA damage and repair.</a> Molecular biotechnology. 26, 249-261 (2004).</li><li>Fairbairn, D. W., Olive, P. L., O'Neill, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay:+a+comprehensive+review.">The comet assay: a comprehensive review.</a> Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. 339, 37-59 (1995).</li><li>Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase+3B+inhibition+enhances+repair+of+DNA+double-strand+breaks+in+irradiated+hippocampal+neurons.">Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons.</a> Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).</li><li>Yang, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lithium-mediated+protection+of+hippocampal+cells+involves+enhancement+of+DNA-PK+dependent+repair+in+mice.">Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice.</a> The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).</li><li>Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+modulation+of+DNA+repair+in+a+human+intervention+study.">Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study.</a> Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).</li><li>Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hOGG1+recognizes+oxidative+damage+using+the+comet+assay+with+greater+specificity+than+FPG+or+ENDOIII.">hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII.</a> Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).</li><li>Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+8-oxoguanine+DNA+glycosylase.">Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).</li><li>Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+hOGG1,+a+human+homolog+of+the+OGG1+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).</li><li>Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+gammaH2AX+foci+as+an+indication+of+lethal+DNA+lesions.">Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions.</a> BMC Cancer. 10, 4 (2010).</li><li>Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+sensitivity,+H2AX+phosphorylation,+and+kinetics+of+repair+of+DNA+strand+breaks+in+irradiated+cervical+cancer+cell+lines.">Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines.</a> Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).</li><li>Bonner, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[gamma]H2AX+and+cancer.">[gamma]H2AX and cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 8, 957-967 (2008).</li><li>Finney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+Field+Gel+Electrophoresis.">Pulsed Field Gel Electrophoresis.</a> Current protocols in molecular biology. , (2000).</li><li>Electrophoresis, F. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pulsed-field gel electrophoresis. , (2000).</li><li>Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+poly+(ADP-Ribose)+polymerase+inhibitor+ABT-888+reduces+radiation-induced+nuclear+EGFR+and+augments+head+and+neck+tumor+response+to+radiotherapy.">The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy.</a> Radiotherapy and Oncology. , (2011).</li></ol>

Assay השביט יש את היכולת הייחודית של ניתוח תאים בודדים. זהו יתרון בזיהוי של אוכלוסיות של תאים הממחישות תגובת הפרש לסוכנים ציטוטוקסיות. כמה מגבלות מעשיות צריכות להילקח בחשבון. מספר התאים שניתן להעריך בנפרד עשוי להשתנות בהתאם לפרט. גודל המדגם צריך להיות מוגבר אם יש שונה ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> 1.5 צינורות מ&quot;ל </td><td> סנט קרוז ביוטכנולוגיה, Inc </td><td> SC-200271 </td><td></td></tr><tr><td> TBE 10X (טריס בסיס, חומצה בורה, EDTA) </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> BP13331 </td><td></td></tr><tr><td> 15 מיליליטר צינור </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 0553851 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> סיגמא </td><td> A5093 </td><td></td></tr><tr><td> רדיד אלומיניום </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 01213101 </td><td></td></tr><tr><td> כוס </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> FB102300 </td><td></td></tr><tr><td> סרכזת </td><td> Thermo Scientific </td><td> 75004261PR </td><td></td></tr><tr><td> תוכנת Assay שביט </td><td> מערכת השביט Assay IV תמונת ניתוח </td><td></td><td></td></tr><tr><td> גליל </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 08555F </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 15575 </td><td></td></tr><tr><td> קאמרי אלקטרופורזה </td><td> Thermo Scientific </td><td> 09528101 </td><td></td></tr><tr><td> אתנול </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> A407P4 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ פלורסנט </td><td> Zeiss Vision Axio </td><td></td><td> כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן ירוק יספיק </td></tr><tr><td> Hemacytometer </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 0267152 </td><td></td></tr><tr><td> נקודת התכה הנמוך agarose </td><td> Promega </td><td> V2111 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוגל </td><td> סרס </td><td></td><td></td></tr><tr><td> פוספט שנאגר סידן, מגנזיום המלוח, חופשי חופשי </td><td> HyClone </td><td> SH3025601 </td><td></td></tr><tr><td> אספקת חשמל </td><td> BioRad </td><td> 1645050 </td><td></td></tr><tr><td> מקרר </td><td> סרס </td><td></td><td></td></tr><tr><td> שליט </td><td> סטייפלס </td><td></td><td></td></tr><tr><td> להחליק </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 12550143 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן כלורי </td><td> סיגמא </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן הידרוקסידי </td><td> סיגמא </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן Lauryl sarcosinate </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> S529 </td><td></td></tr><tr><td> Sybr ירוק </td><td> Invitrogen </td><td> S7585 </td><td></td></tr><tr><td> מגש </td><td> FISהמדעי </td><td> 15242B </td><td></td></tr><tr><td> טריס בסיס </td><td> סיגמא </td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> סיגמא </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> טריפסין </td><td> HyClone </td><td> SH3023601 </td><td></td></tr><tr><td> מערבולת </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 02216108 </td><td></td></tr><tr><td> אמבט מים </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 154622Q </td><td></td></tr></tbody></table>

assaying dna damage in hippocampal neurons using the comet assay

מספר התרופות למקד את מסלולי תיקון DNA ולגרום לתא הורג על ידי יצירת ניזק לדנ&quot;א. לפיכך, תהליכים ישירות למדידת ניזק לדנ&quot;א נבדקו בהרחבה. שיטות מסורתיות הן זמן, משאבים רבים, יקרים אינטנסיביים ודורשות תאים משתכפלים. לעומת זאת, בדיקת השביט, assay אלקטרופורזה ג&#39;ל תא בודד, הנה אמצעי מהיר, לא פולשנית, זול, ישיר ורגיש של ניזק לדנ&quot;א ותיקון. כל הצורות של ניזק לדנ&quot;א, כמו גם תיקון DNA יכולות להיות דמיינו ברמת התא הבודדה באמצעות טכניקה זו עצמה. העיקרון העומד ביסוד assay השביט הוא שדנ&quot;א שלם הוא הורה מאוד ואילו ניזק לדנ&quot;א משבש את הארגון הזה. מחלחל לתוך DNA הפגום agarose המטריצה ​​וכאשר נתון שדה חשמלי, ה-DNA הטעון שלילי נודד לכיוון הקתודה הטעונה במטען חיובי. את גדילי הדנ&quot;א הניזוק הגדולים אינם מסוגלים להעביר רחוק מהגרעין. ניזק לדנ&quot;איוצר מקטעי דנ&quot;א קטנים שנוסעים רחוק יותר מאשר ה-DNA בשלמותה. השביט Assay, תוכנת תמונת ניתוח, אמצעים ומשווה את עוצמת הניאון הכוללת של ה-DNA בגרעין עם DNA שהגר אל מחוץ לגרעין. אות ניאון מהדנ&quot;א הגר פרופורציונלית לניזק לדנ&quot;א. זנב דנ&quot;א כבר בהיר מסמל גדל ניזק לדנ&quot;א. חלק מהפרמטרים שנמדדו הוא רגע זנב שהוא מדד של שניהם כמות ה-DNA וההפצה של ה-DNA בזנב, אורך הזנב והאחוז של ה-DNA בזנב. בדיקה זו מאפשרת למדוד תיקון DNA גם מאז רזולוציה של ניזק לדנ&quot;א מסמנת תיקון התרחש. המגבלה של רגישות היא כ 50 הפסקות גדיל ל1,2 התא דיפלואידי יונקים. תאים שטופלו עם כל סוכנים מזיקים DNA, כגון etoposide, יכולים לשמש כביקורת חיובית. כך assay השביט הוא הליך מהיר ויעיל למדידת ניזק לדנ&quot;א.

Watch this Scientific Journal Video about Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay at JoVE.com

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Assay השביט הוא דרך יעילה לאיתור הפסקות בודדות וגדיל כפול, לרבות אתרים אלקלי רופפים וDNA-DNA/DNA-protein-קישורי צלב שעל ה-DNA בכל התאים, כוללים נוירונים ביפוקמפוס. השיטה מנצלת את הגירת ההפרש של ה-DNA בשדה חשמלי בשל הבדלים בכמות הניזק לדנ&quot;א.

Assaying ניזק לדנ&quot;א בנוירונים ביפוקמפוס שימוש Assay השביט

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection ותרבות ראשונית של נוירונים בהיפוקמפוס עכבר עובריים קליפתיים

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Neuromodulation ותחבורה מיטוכונדריאלי: הדמיה חיה נוירונים בהיפוקמפוס פני משכי זמן ארוכים

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

בידוד והתרבות של נוירונים בהיפוקמפוס מעכברים טרום לידתי

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

איתור של palmitoylation חלבון בנוירונים ביפוקמפוס מתורבתים ידי immunoprecipitation וacyl-Exchange ביוטין (אייב)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

סידן פוספט Transfection של ראשוני נוירונים בהיפוקמפוס

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

הדמיה קוצים הדנדריטים של העכברוש הראשי נוירונים בהיפוקמפוס באמצעות מובנה תאורה מיקרוסקופית

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

הקרינה ופליטת אור הדמיה של Ca subcellular<sup&gt; 2 +</sup&gt; בבני נוירונים בהיפוקמפוס

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Stripe Assay לחקר פעילות דוחה או מושך של מצע חלבון באמצעות ניתק נוירונים בהיפוקמפוס

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

הערכת המורכבות בהיפוקמפוס דנדריטי בעכברים בגילאים בשיטת Golgi-Cox

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...