Name: assaying dna damage in hippocampal neurons using the comet assay
Uploaded: 2012-12-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal Premio IMPACT del Dipartimento di Radioterapia Oncologica, University of Alabama-Birmingham Comprehensive Cancer Center, Cancer Foundation i bambini da combattimento, e la Gabrielle Angelo Foundation (a ESY.).

1. Colture Cellulari <ol><li> Cellule Cultura neuronali e trattarli come necessario. </li><li> Cellule Harvest in provette da 15 ml: i media aspirato, sciacquare con tampone fosfato salino (PBS, calcio e magnesio libero), aggiungere tripsina, raccogliere in provette da 15 ml e neutralizzare tripsina con appropriati mezzi di siero contenenti. </li><li> Centrifugare a 1.000 xg per 5 min. </li><li> Aspirare media. </li><li> Risospendere le cellule in PBS. </li><li> Centrifugare a 1.000 xg per 5 min. </li><li> Aspirare me...

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	<li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay:+a+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells.">The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).</li><li>Hovhannisyan, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+in+combination+with+the+comet+assay+and+micronucleus+test+in+genetic+toxicology.">Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology.</a> Mol. Cytogenet. 3, (2010).</li><li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay.+An+overview+of+techniques.">The comet assay. An overview of techniques.</a> Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).</li><li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+DNA+damage+in+individual+cells+by+analysis+of+histone+H2AX+phosphorylation.">Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation.</a> Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).</li><li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+comet+assay+in+radiobiology.">Impact of the comet assay in radiobiology.</a> Mutat. Res. 681, 13-23 (2009).</li><li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+H2AX+phosphorylation+after+exposure+to+cisplatin.">Kinetics of H2AX phosphorylation after exposure to cisplatin.</a> Cytometry B Clin. Cytom. 76, 79-90 (2009).</li><li>Olive, P. L., Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+DNA+damage+using+the+comet+assay.">Heterogeneity in DNA damage using the comet assay.</a> Cytometry A. 66, 1-8 (2005).</li><li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair.">The comet assay for DNA damage and repair.</a> Molecular biotechnology. 26, 249-261 (2004).</li><li>Fairbairn, D. W., Olive, P. L., O'Neill, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay:+a+comprehensive+review.">The comet assay: a comprehensive review.</a> Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. 339, 37-59 (1995).</li><li>Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase+3B+inhibition+enhances+repair+of+DNA+double-strand+breaks+in+irradiated+hippocampal+neurons.">Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons.</a> Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).</li><li>Yang, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lithium-mediated+protection+of+hippocampal+cells+involves+enhancement+of+DNA-PK+dependent+repair+in+mice.">Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice.</a> The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).</li><li>Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+modulation+of+DNA+repair+in+a+human+intervention+study.">Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study.</a> Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).</li><li>Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hOGG1+recognizes+oxidative+damage+using+the+comet+assay+with+greater+specificity+than+FPG+or+ENDOIII.">hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII.</a> Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).</li><li>Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+8-oxoguanine+DNA+glycosylase.">Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).</li><li>Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+hOGG1,+a+human+homolog+of+the+OGG1+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).</li><li>Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+gammaH2AX+foci+as+an+indication+of+lethal+DNA+lesions.">Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions.</a> BMC Cancer. 10, 4 (2010).</li><li>Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+sensitivity,+H2AX+phosphorylation,+and+kinetics+of+repair+of+DNA+strand+breaks+in+irradiated+cervical+cancer+cell+lines.">Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines.</a> Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).</li><li>Bonner, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[gamma]H2AX+and+cancer.">[gamma]H2AX and cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 8, 957-967 (2008).</li><li>Finney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+Field+Gel+Electrophoresis.">Pulsed Field Gel Electrophoresis.</a> Current protocols in molecular biology. , (2000).</li><li>Electrophoresis, F. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pulsed-field gel electrophoresis. , (2000).</li><li>Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+poly+(ADP-Ribose)+polymerase+inhibitor+ABT-888+reduces+radiation-induced+nuclear+EGFR+and+augments+head+and+neck+tumor+response+to+radiotherapy.">The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy.</a> Radiotherapy and Oncology. , (2011).</li></ol>

Il test della cometa ha la capacità unica di analizzare cellule singole. Ciò è vantaggioso in identificazione di sottopopolazioni di cellule che dimostrano risposta differenziale ad agenti citotossici. Alcune limitazioni pratiche devono essere presi in considerazione. Il numero di celle che possono essere valutati singolarmente possono variare a seconda dell&#39;individuo. La dimensione del campione deve essere aumentato se vi sono variazioni nei danni al DNA all&#39;interno di una popolazione. Vitale cella singola s...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> 1,5 ml provette </td><td> Santa Cruz Biotechnology, Inc </td><td> Sc-200271 </td><td></td></tr><tr><td> 10X TBE (Tris base, acido borico, EDTA) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP13331 </td><td></td></tr><tr><td> Provetta da 15 ml </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0553851 </td><td></td></tr><tr><td> Agarosio </td><td> Sigma </td><td> A5093 </td><td></td></tr><tr><td> Alluminio foil </td><td> Fisher Scientific </td><td> 01213101 </td><td></td></tr><tr><td> Coppa </td><td> Fisher Scientific </td><td> FB102300 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuga </td><td> Thermo Scientific </td><td> 75004261PR </td><td></td></tr><tr><td> Comet Assay software </td><td> Comet Assay IV System Image Analysis </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cilindro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08555F </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 15575 </td><td></td></tr><tr><td> Elettroforesi camera di </td><td> Thermo Scientific </td><td> 09528101 </td><td></td></tr><tr><td> Etanolo </td><td> Fisher Scientific </td><td> A407P4 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio a fluorescenza </td><td> Zeiss Axio Vision </td><td></td><td> Ogni microscopio a fluorescenza con filtro verde sarà sufficiente </td></tr><tr><td> Emocitometro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0267152 </td><td></td></tr><tr><td> Basso punto di fusione agarosio </td><td> Promega </td><td> V2111 </td><td></td></tr><tr><td> Microonda </td><td> Sears </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Soluzione tampone fosfato, calcio libero, magnesio libero </td><td> HyClone </td><td> SH3025601 </td><td></td></tr><tr><td> Alimentazione </td><td> BioRad </td><td> 1645050 </td><td></td></tr><tr><td> Frigorifero </td><td> Sears </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Righello </td><td> Staples </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Scorrere </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12550143 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> Soda caustica </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio lauril sarcosinato </td><td> Fisher Scientific </td><td> S529 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green </td><td> Invitrogen </td><td> S7585 </td><td></td></tr><tr><td> Vassoio </td><td> Fisla scientifica </td><td> 15242B </td><td></td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> Sigma </td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X 100 </td><td> Sigma </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> HyClone </td><td> SH3023601 </td><td></td></tr><tr><td> Vortice </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02216108 </td><td></td></tr><tr><td> Bagnomaria </td><td> Fisher Scientific </td><td> 154622Q </td><td></td></tr></tbody></table>

assaying dna damage in hippocampal neurons using the comet assay

Un certo numero di farmaci indirizzare i percorsi di riparazione del DNA e indurre cellule uccidere con la creazione di danno al DNA. Così, i processi per misurare direttamente il danno al DNA sono stati ampiamente valutati. I metodi tradizionali sono in termini di tempo, costosa, molte risorse e richiedono cellule replica. In contrasto, il test della cometa, un unico gel test cellulare elettroforesi, è più veloce, non invasivo, economico, misura diretta e sensibile di danno e riparazione del DNA. Tutte le forme di danno al DNA e riparazione del DNA possono essere visualizzate a livello di singola cellula utilizzando questa tecnica potente. Il principio alla base del test della cometa è che il DNA intatto è altamente ordinato che i danni del DNA sconvolge questa organizzazione. Le sorgenti di DNA danneggiato nella matrice di agarosio e quando sottoposto ad un campo elettrico, il DNA carico negativamente migra verso il catodo, che è caricato positivamente. Le grandi filamenti di DNA non danneggiati non sono in grado di migrare lontano dal nucleo. Danno al DNAcrea frammenti di DNA più piccole che viaggiano oltre la DNA intatto. Comet Assay, un software di analisi delle immagini, misure e confronta l&#39;intensità complessiva fluorescente del DNA nel nucleo con il DNA che è migrata dal nucleo. Segnale fluorescente dal DNA migrato è proporzionale al danno del DNA. Coda DNA più lungo luminoso indica il danno al DNA è aumentato. Alcuni dei i parametri che vengono misurati sono momento tail che è una misura della sia la quantità di DNA e distribuzione del DNA nella lunghezza tail, tail e percentuale di DNA nella coda. Questo test permette di misurare la riparazione del DNA e da risoluzione del danno al DNA significa riparazione ha avuto luogo. Il limite di sensibilità è di circa 50 rotture di filamenti per 1,2 cellula diploide mammiferi. Cellule trattati con un qualsiasi agenti DNA dannosi come etoposide, possono essere utilizzato come controllo positivo. Così il test della cometa è una procedura rapida ed efficace per misurare la danno al DNA.

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Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Il test della cometa è un modo efficiente di rilevare rotture a singolo e doppio filamento, compresi alcali-labili siti e DNA-DNA/DNA-protein legami incrociati sul DNA in tutte le cellule, compresi i neuroni dell&#39;ippocampo. Il metodo sfrutta la migrazione differenziale di DNA in un campo elettrico dovuto a differenze nelle quantità di danno al DNA.

Il saggio danneggiare il DNA in neuroni ippocampali Utilizzo del Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection e cultura primaria di neuroni embrionali di topo ippocampale e corticale

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Neuromodulazione e mitocondriale di trasporto: Imaging Live in neuroni dell&#39;ippocampo oltre durate a lungo

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Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Rilevamento di palmitoilazione proteina in colture di neuroni ippocampali di immunoprecipitazione e di acil-Biotina Exchange (ABE)

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Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

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Imaging spine dendritiche di Rat Primaria neuroni dell&#39;ippocampo utilizzando Structured Illumination Microscopy

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Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

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Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

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Stripe Assay per studiare l&#39;attività attrattiva o repulsiva di un substrato proteico Utilizzando dissociata neuroni dell&#39;ippocampo

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Valutazione della complessità dendritica ippocampale nei topi invecchiati utilizzando il metodo Golgi-Cox

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