Name: assaying dna damage in hippocampal neurons using the comet assay
Uploaded: 2012-12-19T13:00:00
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이 작품은 방사선 종양학, 앨라배마 - 버밍햄 대학 종합 암 센터, 파이팅 어린이 암 재단과 가브리엘의 엔젤 재단 (ESY 있습니다.)의 부에서 IMPACT 상에 의해 지원되었다.

1. 세포 배양 <ol><li> 문화 neuronal 세포와이를 필요에 따라 취급합니다. </li><li> 15 ML 튜브에 수확 세포 : 기음 미디어, 인산염과 린스 (PBS, 칼슘, 마그네슘 무료) 생리 버퍼, 15 ML 튜브에 수집하고 적절한 혈청이 포함 된 미디어와 트립신을 중화, 트립신을 추가합니다. </li><li> 5 분 1,000 XG에서 봐. </li><li> 미디어를 대기음. </li><li> PBS에 세포를 Resuspend. </li><li> 5 분 1,000 XG에서 봐. </li><li> 신선한 PBS에서 미...

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	<li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay:+a+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells.">The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).</li><li>Hovhannisyan, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+in+combination+with+the+comet+assay+and+micronucleus+test+in+genetic+toxicology.">Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology.</a> Mol. Cytogenet. 3, (2010).</li><li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay.+An+overview+of+techniques.">The comet assay. An overview of techniques.</a> Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).</li><li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+DNA+damage+in+individual+cells+by+analysis+of+histone+H2AX+phosphorylation.">Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation.</a> Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).</li><li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+comet+assay+in+radiobiology.">Impact of the comet assay in radiobiology.</a> Mutat. Res. 681, 13-23 (2009).</li><li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+H2AX+phosphorylation+after+exposure+to+cisplatin.">Kinetics of H2AX phosphorylation after exposure to cisplatin.</a> Cytometry B Clin. Cytom. 76, 79-90 (2009).</li><li>Olive, P. L., Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+DNA+damage+using+the+comet+assay.">Heterogeneity in DNA damage using the comet assay.</a> Cytometry A. 66, 1-8 (2005).</li><li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair.">The comet assay for DNA damage and repair.</a> Molecular biotechnology. 26, 249-261 (2004).</li><li>Fairbairn, D. W., Olive, P. L., O'Neill, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay:+a+comprehensive+review.">The comet assay: a comprehensive review.</a> Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. 339, 37-59 (1995).</li><li>Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase+3B+inhibition+enhances+repair+of+DNA+double-strand+breaks+in+irradiated+hippocampal+neurons.">Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons.</a> Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).</li><li>Yang, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lithium-mediated+protection+of+hippocampal+cells+involves+enhancement+of+DNA-PK+dependent+repair+in+mice.">Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice.</a> The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).</li><li>Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+modulation+of+DNA+repair+in+a+human+intervention+study.">Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study.</a> Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).</li><li>Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hOGG1+recognizes+oxidative+damage+using+the+comet+assay+with+greater+specificity+than+FPG+or+ENDOIII.">hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII.</a> Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).</li><li>Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+8-oxoguanine+DNA+glycosylase.">Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).</li><li>Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+hOGG1,+a+human+homolog+of+the+OGG1+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).</li><li>Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+gammaH2AX+foci+as+an+indication+of+lethal+DNA+lesions.">Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions.</a> BMC Cancer. 10, 4 (2010).</li><li>Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+sensitivity,+H2AX+phosphorylation,+and+kinetics+of+repair+of+DNA+strand+breaks+in+irradiated+cervical+cancer+cell+lines.">Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines.</a> Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).</li><li>Bonner, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[gamma]H2AX+and+cancer.">[gamma]H2AX and cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 8, 957-967 (2008).</li><li>Finney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+Field+Gel+Electrophoresis.">Pulsed Field Gel Electrophoresis.</a> Current protocols in molecular biology. , (2000).</li><li>Electrophoresis, F. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pulsed-field gel electrophoresis. , (2000).</li><li>Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+poly+(ADP-Ribose)+polymerase+inhibitor+ABT-888+reduces+radiation-induced+nuclear+EGFR+and+augments+head+and+neck+tumor+response+to+radiotherapy.">The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy.</a> Radiotherapy and Oncology. , (2011).</li></ol>

혜성 분석은 개별 세포를 분석의 고유 한 능력이 있습니다. 이 세포 독성 요원에게 차등 응답을 보여 세포의 subpopulations의 식별에 유리한 것입니다. 몇 실제적인 제한이 고려되어야한다. 개별적으로 평가 될 수있는 세포의 수는 개인에 따라 다를 수 있습니다. 인구 내에서 DNA 손상에 차이가있을 경우 표본의 크기가 증가해야합니다. 괴사 또는 apoptotic 세포의 주된 존재가 에러가 추가되므로 가능한...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 1.5 ML 튜브 </td><td> 산타 크루즈 (Santa Cruz) 생명 공학, Inc의 </td><td> SC-200271 </td><td></td></tr><tr><td> 10X TBE (트리스베이스, 붕소의 산성, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP13331 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ML 튜브 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 0553851 </td><td></td></tr><tr><td> 아가로 오스 </td><td> 시그마 </td><td> A5093 </td><td></td></tr><tr><td> 알루미늄 호일 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 01213101 </td><td></td></tr><tr><td> 굽​​ 달린 큰 컵 </td><td> 피셔 과학 </td><td> FB102300 </td><td></td></tr><tr><td> 원심 분리기 </td><td> 열 과학 </td><td> 75004261PR </td><td></td></tr><tr><td> 혜성 분석 소프트웨어 </td><td> 혜성 분석 IV 이미지 분석 시스템 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 실린더 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 08555F </td><td></td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> GIBCO </td><td> 15,575 </td><td></td></tr><tr><td> 전기 챔버 </td><td> 열 과학 </td><td> 09528101 </td><td></td></tr><tr><td> 에탄올 </td><td> 피셔 과학 </td><td> A407P4 </td><td></td></tr><tr><td> 형광 현미경 </td><td> Zeiss Axio 비전 </td><td></td><td> 그린 필터 가진 형광 현미경은 충분 </td></tr><tr><td> Hemacytometer </td><td> 피셔 과학 </td><td> 0267152 </td><td></td></tr><tr><td> 낮은 녹는 점 아가로 오스 </td><td> Promega </td><td> V2111 </td><td></td></tr><tr><td> 마이크로파 </td><td> 시어스 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 인산염은 무료 생리, 칼슘 무료, 마그네슘 버퍼 </td><td> HyClone </td><td> SH3025601 </td><td></td></tr><tr><td> 전원 공급 장치 </td><td> BioRad </td><td> 1645050 </td><td></td></tr><tr><td> 냉장고 </td><td> 시어스 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 지배자 </td><td> 스테이플 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 슬라이드 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 12550143 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 염화물 </td><td> 시그마 </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> 수산화 나트륨 </td><td> 시그마 </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 라 우릴 sarcosinate </td><td> 피셔 과학 </td><td> S529 </td><td></td></tr><tr><td> Sybr 녹색 </td><td> Invitrogen </td><td> S7585 </td><td></td></tr><tr><td> 쟁반 </td><td> FIS그녀 과학 </td><td> 15242B </td><td></td></tr><tr><td> 트리스베이스 </td><td> 시그마 </td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td> 트리톤 - X 100 </td><td> 시그마 </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> 트립신 </td><td> HyClone </td><td> SH3023601 </td><td></td></tr><tr><td> 소용돌이 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 02216108 </td><td></td></tr><tr><td> 열탕 목욕 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 154622Q </td><td></td></tr></tbody></table>

assaying dna damage in hippocampal neurons using the comet assay

약물의 수는 DNA 복구 경로를 타겟으로하고 세포가 DNA 손상을 만들어 죽 유도. 따라서, 직접 D​​NA 손상을 측정하기위한 프로세스를 광범위하게 평가되었습니다. 전통적인 방법은 시간이 소요, 비용, 리소스를 집중하고 세포가 복제를 필요로합니다. 반면, 혜성 분석, 단일 세포 겔 전기 영동 분석은 DNA 손상 및 수리를 빠르고 비 침습적, 저렴한, 직접 민감한 측정하기위한 한 방법입니다. DNA 손상뿐만 아니라 DNA 수리의 모든 양식이 강력한 기술을 사용하여 단일 세포 수준에서 시각화 할 수 있습니다. 혜성 분석의 기초 원리는 DNA 손상이 조직을 방해 반면에 그대로 DNA가 높은 주문이다. 손상된 DNA의 아가로 오스 매트릭스에 새어 나온 및 전기 분야의 대상이 때, 부정적인 청구 DNA가 긍정적으로 청구됩니다 음극으로 마이그레이션합니다. 큰 피해 DNA의 가닥 훨씬 핵에서 마이그레이션 할 수 없습니다. DNA 손상더 손상 DNA보다 여행 작은 DNA 조각을 만듭니다. 혜성 분석, 이미지 분석 소프트웨어, 조치하고 핵에서 마이그레이션 DNA와 핵에서 DNA의 전체 형광 강도를 비교합니다. 마이그레이션 DNA의 형광 신호가 DNA 손상에 비례합니다. 긴 밝은 DNA 꼬리 증가 DNA 손상을 의미합니다. 측정 매개 변수 중 일부는 꼬리에있는 DNA의 금액과 꼬리, 꼬리 길이 DNA의 유통 및 DNA의 비율 모두의 척도입니다 꼬리 순간입니다. 이 분석은 DNA 손상의 해상도가 복구가 자리를 차지하게 때문에뿐만 아니라 DNA 복구를 측정 할 수 있습니다. 감도의 제한 diploid 포유류의 세포 1,2 당 약 50 스트랜드 나누기입니다. 같은 etoposide와 같은 DNA 손상 대리인과 치료 세포는 긍정적 인 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 따라서 혜성 분석은 DNA 손상을 측정 할 수있는 신속하고 효과적인 절차입니다.

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Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

혜성 분석은 알칼리 불안정한 사이트와 hippocampal 뉴런을 포함한 모든 세포의 DNA에 DNA-DNA/DNA-protein 상호 링크 등 단일 및 이중 가닥 휴식을 검출 효율적인 방법입니다. 방법은 DNA 손상의 양의 차이로 인해 전기 분야에서 DNA의 차동 마이그레이션을 활용합니다.

혜성 분석을 사용하여 Hippocampal 뉴런의 DNA 손상을 시금

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection 및 배아 마우스 Hippocampal과 두피 뉴런의 주요 문화

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

연구

신경과학

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Neuromodulation 및 Mitochondrial 교통 : 긴 기간이 이상 Hippocampal 뉴런의 라이브 영상

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

태아 쥐의 Hippocampal 신경 세포의 분리 및 문화

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Immunoprecipitation 및 아실-비오틴 거래소 (아베)에 의한 양식 Hippocampal 뉴런의 단백질 Palmitoylation의 감지

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

차 해마 신경 세포의 칼슘 인산염 형질

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

구조적 조명 현미경을 사용하여 쥐 차 해마 신경 세포의 돌기 쪽 이미징

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

하는 세포 칼슘의 형광 및 생물 발광 영상<sup&gt; 2 +</sup&gt; 노인 해마 신경 세포에서

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

스트라이프 분석은 해리 해마 신경 세포를 사용하여 단백질 기판의 매력적인 또는 혐오감 활동을 연구하는

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

골지 - 콕스 방법을 이용한 고령의 해마 상피 세포의 수지상 돌기 복잡성 평가

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...