Name: assaying dna damage in hippocampal neurons using the comet assay
Uploaded: 2012-12-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelo Prêmio IMPACTO do Departamento de Radiação Oncológica da Universidade de Alabama-Birmingham Comprehensive Cancer Center, da Fundação da Criança de combate o câncer, ea Gabrielle Anjo (Fundação para ESY.).

1. Cultura de Células <ol><li> Cultura de células neuronais e tratá-los conforme necessário. </li><li> Células de colheita em tubos de 15 ml: meios de aspiração, lavar com solução salina tamponada com fosfato (PBS, cálcio e magnésio livre), adicionar tripsina, recolher em tubos de 15 ml e neutralizar a tripsina com meio contendo soro apropriadas. </li><li> Centrifugação a 1000 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar mídia. </li><li> Ressuspender as células em PBS. </li><li> Centrifugação a 1000 xg durante...

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	<li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay:+a+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells.">The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).</li><li>Hovhannisyan, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+in+combination+with+the+comet+assay+and+micronucleus+test+in+genetic+toxicology.">Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology.</a> Mol. Cytogenet. 3, (2010).</li><li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay.+An+overview+of+techniques.">The comet assay. An overview of techniques.</a> Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).</li><li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+DNA+damage+in+individual+cells+by+analysis+of+histone+H2AX+phosphorylation.">Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation.</a> Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).</li><li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+comet+assay+in+radiobiology.">Impact of the comet assay in radiobiology.</a> Mutat. Res. 681, 13-23 (2009).</li><li>Olive, P. L., Banath, J. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay:+a+comprehensive+review.">The comet assay: a comprehensive review.</a> Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. 339, 37-59 (1995).</li><li>Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase+3B+inhibition+enhances+repair+of+DNA+double-strand+breaks+in+irradiated+hippocampal+neurons.">Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons.</a> Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).</li><li>Yang, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lithium-mediated+protection+of+hippocampal+cells+involves+enhancement+of+DNA-PK+dependent+repair+in+mice.">Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice.</a> The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).</li><li>Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+modulation+of+DNA+repair+in+a+human+intervention+study.">Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study.</a> Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).</li><li>Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hOGG1+recognizes+oxidative+damage+using+the+comet+assay+with+greater+specificity+than+FPG+or+ENDOIII.">hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII.</a> Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).</li><li>Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+8-oxoguanine+DNA+glycosylase.">Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).</li><li>Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+hOGG1,+a+human+homolog+of+the+OGG1+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).</li><li>Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+gammaH2AX+foci+as+an+indication+of+lethal+DNA+lesions.">Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions.</a> BMC Cancer. 10, 4 (2010).</li><li>Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+sensitivity,+H2AX+phosphorylation,+and+kinetics+of+repair+of+DNA+strand+breaks+in+irradiated+cervical+cancer+cell+lines.">Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines.</a> Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).</li><li>Bonner, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[gamma]H2AX+and+cancer.">[gamma]H2AX and cancer.</a> Nat. Rev. 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O teste do cometa tem a capacidade única de analisar células individuais. Isto é vantajoso na identificação de subpopulações de células que demonstram respostas diferenciais aos agentes citotóxicos. Algumas limitações práticas têm de ser tidas em conta. O número de células que podem ser avaliadas individualmente podem variar, dependendo do indivíduo. O tamanho da amostra tem de ser aumentada, se há uma variedade de lesões do ADN dentro de uma população. Suspensão de uma única célula viável é cr?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Tubos de 1,5 ml </td><td> Santa Cruz Biotechnology, Inc </td><td> Sc-200271 </td><td></td></tr><tr><td> TBE 10X (Tris-base, o ácido bórico, EDTA) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP13331 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml de tubo </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0553851 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Sigma </td><td> A5093 </td><td></td></tr><tr><td> Folha de alumínio </td><td> Fisher Scientific </td><td> 01213101 </td><td></td></tr><tr><td> Proveta </td><td> Fisher Scientific </td><td> FB102300 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifugador </td><td> Thermo Scientific </td><td> 75004261PR </td><td></td></tr><tr><td> Cometa software Ensaio </td><td> Comet Assay IV Sistema de Análise de Imagem </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cilindro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08555F </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 15575 </td><td></td></tr><tr><td> Câmara de eletroforese </td><td> Thermo Scientific </td><td> 09528101 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A407P4 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio fluorescente </td><td> Zeiss Axio Vision </td><td></td><td> Qualquer microscópio de fluorescência com filtro verde bastará </td></tr><tr><td> Hemocitômetro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0267152 </td><td></td></tr><tr><td> Baixo ponto de fusão agarose </td><td> Promega </td><td> V2111 </td><td></td></tr><tr><td> Microonda </td><td> Sears </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Salina tamponada com fosfato, cálcio, magnésio, livre livre </td><td> HyClone </td><td> SH3025601 </td><td></td></tr><tr><td> Fonte de alimentação </td><td> BioRad </td><td> 1645050 </td><td></td></tr><tr><td> Geladeira </td><td> Sears </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Governante </td><td> Staples </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deslizar </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12550143 </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de sódio </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> De hidróxido de sódio </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Lauril sarcosinato </td><td> Fisher Scientific </td><td> S529 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green </td><td> Invitrogen </td><td> S7585 </td><td></td></tr><tr><td> Bandeja </td><td> Fisela Científico </td><td> 15242B </td><td></td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> Sigma </td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X 100 </td><td> Sigma </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> HyClone </td><td> SH3023601 </td><td></td></tr><tr><td> Vórtice </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02216108 </td><td></td></tr><tr><td> Banho de água </td><td> Fisher Scientific </td><td> 154622Q </td><td></td></tr></tbody></table>

assaying dna damage in hippocampal neurons using the comet assay

Um certo número de drogas como alvo as vias de reparação do ADN e induzem a morte de células através da criação de danos no DNA. Assim, os processos para medir directamente danos no ADN têm sido extensivamente estudados. Os métodos tradicionais são o tempo de consuming, de recursos,, caro, intensivo e requerem células de replicadoras. Em contraste, o ensaio cometa, uma única célula de ensaio de electroforese em gel, é mais rápido, não invasivo, medida, de baixo custo directo e sensível de danos no DNA e de reparação. Todas as formas de danos no DNA, bem como a reparação do ADN pode ser visualizado no nível de célula única usando esta técnica poderosa. O princípio subjacente ao doseamento é que cometa DNA intacto é altamente ordenada ao passo que o dano ao DNA interrompe essa organização. Os danificadas escoa de ADN na matriz de agarose e quando sujeito a um campo eléctrico, o DNA carregado negativamente migra em direcção ao cátodo, que está carregado positivamente. As grandes cadeias de DNA não danificadas não são capazes de migrar longe do núcleo. Danos no DNAcria fragmentos menores de DNA que viajam mais longe do que o DNA intacta. Comet Assay, um software de de análise de imagem, as medidas de e compara o global de intensidade de fluorescente de o DNA em o com um núcleo com DNA de que tenha migrado para fora de o núcleo. Sinal fluorescente do DNA migrado é proporcional aos danos de DNA. Tail DNA mais brilhante significa danos no DNA aumentada. Alguns dos parâmetros que são medidos são momento da cauda, ​​que é uma medida de tanto a quantidade de ADN e de distribuição de ADN no comprimento da cauda a cauda, ​​e percentagem de DNA na cauda. Este ensaio permite medir a reparação do ADN, bem desde resolução de danos no DNA significa reparação teve lugar. O limite de sensibilidade é de aproximadamente 50 quebras na cadeia por diplóide 1,2 células de mamíferos. As células tratadas com quaisquer agentes que danificam o ADN, tais como o etoposido, pode ser utilizado como um controlo positivo. Assim, o teste do cometa é um procedimento rápido e eficaz para avaliar os danos do DNA.

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Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

O ensaio cometa é uma forma eficiente de detectar quebras simples e de fita dupla, incluindo álcali-lábeis sites e DNA-DNA/DNA-protein ligações cruzadas no DNA em todas as células, incluindo neurônios do hipocampo. O método tira partido da migração diferencial de DNA num campo eléctrico devido a diferenças na quantidade de danos no DNA.

Ensaio danos no DNA em neurônios do hipocampo Usando o Ensaio Cometa

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection e Cultura Primária de Neurônios do hipocampo do rato embrionárias e Cortical

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Neurociência

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Neuromodulação e Transportes mitocondrial: Imagens ao vivo em neurônios do hipocampo durante muito tempo

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Isolamento e Cultura de neurônios do hipocampo de ratos pré-natal

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Detecção de palmitoylation proteína em neurônios cultivados por imunoprecipitação e Acil-Biotina Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Fosfato de cálcio transfecção de primário neurônios do hipocampo

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imagiologia espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo de rato primária usando Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescência e imagem de bioluminescência subcelular Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Aged em neurônios do hipocampo

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Stripe Ensaio para estudar a atividade atração ou repulsão de um substrato de proteína utilizando dissociado neurônios do hipocampo

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Avaliação da complexidade dendrítica do hipocampo em ratos idosos usando o método de Golgi-Cox

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...