Name: screening for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model
Uploaded: 2012-11-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model at JoVE.com

Wij danken dr. Leonard I. Zon in wiens laboratorium deze technieken werden in eerste instantie ontwikkeld, Kristen Kwan en de late Chi-Bin Chien voor geschenken van plasmiden gebruikt in dit werk, James Lister en David Raible voor hulp bij antilichaamkleuring, en James Neiswender voor het micro-injectie video. Dit werk werd gefinancierd door NIH subsidie ​​R00AR056899-03 naar CJC

1. Screening op Melanoom Begin Modifiers <ol><li> Gateway maken middelste item klonen van PCR amplificeren van de volledige lengte open leesraam van genen van belang (GOI) en genereert in pDONR 221 met BP clonase II (Invitrogen). Gebruik Multisite Gateway-technologie (Invitrogen) te recombineren p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit # 302 p3E_SV40polyA 6 en miniCoopR 5 tot genen van interesse onder het mitfa promoter in de vector miniCoopR (Figuur 1A). </li><li> Injecteer...

<ol>
	<li>Beroukhim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+somatic+copy-number+alteration+across+human+cancers.">The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers.</a> Nature. 463, 899-905 (2010).</li><li>Curtin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+sets+of+genetic+alterations+in+melanoma.">Distinct sets of genetic alterations in melanoma.</a> N. Engl. J. Med. 353, 2135-2147 (2005).</li><li>Lin, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+genomic+diversity+and+tumor+dependency+in+malignant+melanoma.">Modeling genomic diversity and tumor dependency in malignant melanoma.</a> Cancer Res. 68, 664-673 (2008).</li><li>Patton, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+mutations+are+sufficient+to+promote+nevi+formation+and+cooperate+with+p53+in+the+genesis+of+melanoma.">BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma.</a> Curr. Biol. 15, 249-254 (2005).</li><li>Ceol, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+methyltransferase+SETDB1+is+recurrently+amplified+in+melanoma+and+accelerates+its+onset.">The histone methyltransferase SETDB1 is recurrently amplified in melanoma and accelerates its onset.</a> Nature. 471, 513-517 (2011).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev. Dyn. 236, 3088-3099 (2007).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function.">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li><li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants.">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).</li></ol>

De miniCoopR methode maakt het mogelijk de expressie van genen van belang in zebravis melanocyten. Deze benadering maakt gebruik van het feit dat de zebravis mitfa gen werkt cellen autonoom. Daarom melanocyten gered door de miniCoopR vector zeker het minigen en elk gen van belang waaraan het fysiek gekoppeld bevatten. Gered melanocyten zijn duidelijk zichtbaar en kunnen worden verkregen in dieren die zijn geïnjecteerd als eencellige embryo. Een gespecificeerde mate van chimerisme is geselecteerd, en dieren ove...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Gateway recombinatie reagentia </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> miniCoopR </td><td></td><td></td><td> Reference 5 </td></tr><tr><td> Mitfa antilichaam </td><td></td><td></td><td> Reference 5 </td></tr><tr><td> FITC geit anti-konijn IgG antilichaam </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Labs </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> casper zebravis </td><td></td><td></td><td> Referentie 9 </td></tr><tr><td> 701N 10 pi Syringe </td><td> Hamilton / Fisher </td><td> 14 tot 824 </td><td> &amp;nbsp; </td></tr><tr><td> 40 uM filter </td><td> BD Falcon / Fisher </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 26140079 </td><td></td></tr></tbody></table>

screening for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model

Genomische studies van menselijke kankers heeft geleid tot een schat aan informatie over genen die veranderd in tumoren 1,2,3. Een uitdaging van deze studies is dat veel genen gewijzigd en het kan moeilijk zijn om genetische veranderingen die tumorigenese van dat die incidenteel ontstaan ​​tijdens de transformatie reed onderscheiden. Om dit onderscheid is het nuttig om een ​​assay die kwantitatief meten van het effect van een veranderd gen op tumor initiatie en andere processen waarmee tumoren aanhouden en verspreiden. Hier wordt een snelle manier om grote aantallen kandidaat melanoom modifiers screenen zebravis met een autochtone tumor model 4 die stappen voor melanoom initiëren en onderhouden omvat. Een belangrijk reagens in deze test is de miniCoopR vector voor koppeling een wildtype kopie van het mitfa melanocyt specificatie factor een Gateway cassette recombinatie waarin kandidaat melAnoma genen worden gerecombineerd 5. De vector miniCoopR een mitfa redding minigen dat de promoter, open reading frame en 3&#39;-ongetranslateerde gebied van het wild-type gen bevat mitfa. Het stelt ons in staat om constructies met behulp van volledige lengte open reading frames van kandidaat-melanoom modifiers. Deze individuele klonen kunnen vervolgens worden geïnjecteerd in een enkele cel Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (lf); mitfa (lf) zebravis embryo&#39;s. De miniCoopR vector wordt geïntegreerd door Tol2-gemedieerde transgenese 6 en redt melanocyten. Omdat deze fysiek gekoppeld met de mitfa rescuing minigen worden kandidaatgenen uitgedrukt in gered melanocyten, waarvan sommige transformeren en ontwikkelen tot tumoren. Het effect van een kandidaat gen op melanoom initiatie en melanoomcellijnen eigenschappen kan worden gemeten met melanoma-overleving curves, invasie assays, antilichaamkleuring en transplantatie assays.

Eencellige Tg (mitfa: BRAF V600E), p53 (lf) mitfa (lf) zebravis embryo&#39;s werden geïnjecteerd met de miniCoopR vector die het melanoma oncogen SETDB1 5 of EGFP, elk onder de controle van de promoter mitfa. Embryo&#39;s met melanocyt rescue werden geselecteerd en rijpen. Op 2 maanden dieren melanocyt rescue groter dan 4 mm 2 werden geselecteerd. De dieren werden wekelijks onderzocht melanomen. Tumorincidentie curves voor volwassenen bleek dat de SETDB1</em...

Watch this Scientific Journal Video about Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model at JoVE.com

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Een snelle manier om te screenen op melanoom modifiers met behulp van een zebravis autochtone tumor model gepresenteerd. Het maakt gebruik van de miniCoopR vector waarmee expressie van genen kandidaat melanoom in melanocyten. Een methode om melanoom-vrije overleving bochten, een invasie assay, een protocol voor antilichaam kleuring van schaal melanocyten en een melanoom transplantatie assay te verkrijgen zijn beschreven.

Screening op Melanoom Modifiers het gebruik van een zebravis Autochtone tumormodel

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Multi-foton Imaging van de tumorcel invasie in een orthotope Muis Model van Oral plaveiselcelcarcinoom

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Het beoordelen van Teratogene Veranderingen in een zebravis model van foetale blootstelling aan alcohol

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Human Neuro-endocriene tumor cellijnen als een drie-dimensionaal model voor de studie van de mens Neuro-endocriene Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patiënt Derived Cell Cultuur en isolatie van CD133<sup&gt; +</sup&gt; Vermeende Cancer Stem Cells van Melanoom

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory

De zebravis als model bij diabetes mellitus en Metabole Geheugen

Diabetes mellitus currently affects 346 million individuals and this is projected to increase to 400 million by 2030. Evidence from both the laboratory ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel Hoge-resolutie<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging techniek om de Dynamic Response van intracraniële structuren om tumorgroei en Therapeutics Studie

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Een mogelijke zebravis model van PKD: Knockdown van<em&gt; Wnt5a</em&gt; Oorzaken Cysten in zebravis Nieren

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Driedimensionale Co-cultuur Model voor Tumor-stromale Interactie

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Isolated Hepatic Perfusion as a Treatment for Liver Metastases of Uveal Melanoma

Geïsoleerde leverperfusie voor de behandeling van leveruitzaaiingen van oogmelanoom

Isolated hepatic perfusion (IHP) is a procedure where the liver is surgically isolated and perfused with a high concentration of the chemotherapeutic ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Evaluatie van tumor-infiltrerende leukocyten subsets in een subcutane tumormodel

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...