Name: screening for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model
Uploaded: 2012-11-13T13:00:00
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Nous remercions le Dr Leonard I. Zon en laboratoire dont ces techniques ont été initialement développées; Kristen Kwan et la fin des années Chi-Bin Chien pour les dons de plasmides utilisés dans ce travail; James Lister et David Raible de l&#39;aide pour coloration des anticorps, et James Neiswender pour la micro-injection vidéo. Ce travail a été financé par le NIH subvention R00AR056899-03 à CJC

1. Dépistage du mélanome Modificateurs Onset <ol><li> Créer des clones de passerelle moyen d&#39;entrée par PCR amplifiant le cadre de pleine longueur de lecture ouvert de gènes d&#39;intérêt (GOI) et la recombinaison en utilisant les batteries BP 221 pDONR clonase II (Invitrogen). Utilisez la technologie de passerelle multi-sites (Invitrogen) pour recombiner p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit N ° 302 p3E_SV40polyA 6 et miniCoopR 5 afin d&#39;ajouter des gènes d&#39;intérêt dans le c...

<ol>
	<li>Beroukhim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+somatic+copy-number+alteration+across+human+cancers.">The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers.</a> Nature. 463, 899-905 (2010).</li><li>Curtin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+sets+of+genetic+alterations+in+melanoma.">Distinct sets of genetic alterations in melanoma.</a> N. Engl. J. Med. 353, 2135-2147 (2005).</li><li>Lin, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+genomic+diversity+and+tumor+dependency+in+malignant+melanoma.">Modeling genomic diversity and tumor dependency in malignant melanoma.</a> Cancer Res. 68, 664-673 (2008).</li><li>Patton, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+mutations+are+sufficient+to+promote+nevi+formation+and+cooperate+with+p53+in+the+genesis+of+melanoma.">BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma.</a> Curr. Biol. 15, 249-254 (2005).</li><li>Ceol, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+methyltransferase+SETDB1+is+recurrently+amplified+in+melanoma+and+accelerates+its+onset.">The histone methyltransferase SETDB1 is recurrently amplified in melanoma and accelerates its onset.</a> Nature. 471, 513-517 (2011).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev. Dyn. 236, 3088-3099 (2007).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function.">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li><li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants.">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).</li></ol>

La méthode miniCoopR permet l&#39;expression de gènes d&#39;intérêt dans les mélanocytes de poisson zèbre. Cette approche tire parti du fait que le gène poisson zèbre mitfa agit cellulaire-autonome. Pour cette raison, les mélanocytes sauvés par le vecteur miniCoopR êtes certain de contenir le minigène et tout gène d&#39;intérêt auquel il est couplé physiquement. Rescued mélanocytes sont clairement visibles et peuvent être obtenus chez les animaux qui ont été injectés dans des embryons unice...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Réactifs de recombinaison passerelle </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> miniCoopR </td><td></td><td></td><td> Référence 5 </td></tr><tr><td> Anticorps Mitfa </td><td></td><td></td><td> Référence 5 </td></tr><tr><td> FITC de chèvre anti-IgG de lapin </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Labs </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> casper le poisson-zèbre </td><td></td><td></td><td> Référence 9 </td></tr><tr><td> 701N seringue de 10 ul </td><td> Hamilton / Fisher </td><td> 14-824 </td><td> &amp;nbsp; </td></tr><tr><td> 40 uM de filtre </td><td> BD Falcon / Fisher </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 26140079 </td><td></td></tr></tbody></table>

screening for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model

Les études génomiques de cancers humains ont révélé une mine de renseignements sur les gènes qui sont altérés dans les tumeurs 1,2,3. Un défi découlant de ces études est que de nombreux gènes sont altérés, et il peut être difficile de distinguer les altérations génétiques qui ont poussé la tumorigenèse de ceux qui se leva d&#39;ailleurs lors de la transformation. Pour faire cette distinction, il est utile d&#39;avoir un test qui peut mesurer quantitativement l&#39;effet d&#39;un gène modifié sur l&#39;initiation de la tumeur et d&#39;autres procédés qui permettent tumeurs à persister et à diffuser. Nous présentons ici un moyen rapide pour cribler un grand nombre de modificateurs de mélanome chez le poisson zèbre candidats à l&#39;aide d&#39;un 4 tumeurs autochtones modèle qui englobe les étapes nécessaires à l&#39;initiation et le maintien du mélanome. Un réactif clé dans ce test est le vecteur miniCoopR, qui couple une copie de type sauvage de la spécification facteur mitfa mélanocytes à une cassette de recombinaison dans lequel la passerelle candidate melAnoma gènes peuvent être recombinées 5. Le vecteur a un minigène miniCoopR sauvetage mitfa qui contient le promoteur, le cadre de lecture ouvert et la région 3 &#39;non traduite du gène de type sauvage mitfa. Il nous permet de faire des constructions à l&#39;aide de longue durée cadres ouverts de lecture de modificateurs de mélanome candidats. Ces clones individuels peuvent ensuite être injecté dans la cellule unique Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (lf); embryons de poisson zèbre mitfa (lf). Le vecteur miniCoopR obtient intégré par Tol2 médiée par transgénèse 6 et sauve mélanocytes. Parce qu&#39;ils sont physiquement couplé à la minigène mitfa sauvetage, les gènes candidats sont exprimés dans les mélanocytes rescapés, dont certains vont transformer et se développer en tumeurs. L&#39;effet d&#39;un gène candidat à l&#39;initiation du mélanome et des cellules de mélanome peut être mesurée à l&#39;aide des courbes de survie sans mélanome, des essais d&#39;invasion, la coloration d&#39;anticorps et les essais de transplantation.

Une cellule-Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (lf); embryons de poisson zèbre mitfa (LF) ont été injectés avec le vecteur contenant l&#39;oncogène miniCoopR mélanome SETDB1 5 ou EGFP, chacun sous le contrôle du promoteur mitfa. Embryons sauvetage mélanocytes ont été sélectionnés et ont permis de mûrir. À 2 mois d&#39;âge avec des animaux sauvetage mélanocytes supérieure à 4 mm 2 ont été sélectionnés. Les animaux ont été examinés par se...

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Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Un moyen rapide pour le dépistage de modificateurs de mélanome en utilisant un modèle de tumeur poisson zèbre autochtone est présenté. Il tire profit du vecteur miniCoopR qui permet l&#39;expression de gènes candidats de mélanome dans les mélanocytes. Une méthode pour obtenir des courbes de survie sans mélanome, un dosage invasion, un protocole pour la coloration d&#39;anticorps de mélanocytes échelle et un essai de transplantation mélanome sont décrits.

Dépistage du mélanome Modificateurs l&#39;aide d&#39;un modèle de tumeur Zebrafish Autochtone

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Multi-photon imagerie de l&#39;invasion des cellules tumorales dans un modèle de souris orthotopique du carcinome épidermoïde oral

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Recherche

Médecine

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Évaluer les changements tératogènes dans un modèle de poisson zèbre de l&#39;exposition d&#39;alcoolisation fœtale

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

L&#39;homme neuroendocriniennes lignées cellulaires tumorales comme un modèle tridimensionnel pour l&#39;étude de la thérapie des tumeurs neuro-endocrines humaines

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Culture cellulaire dérivée et isolement de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putatifs cellules souches du cancer du mélanome

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory

Un modèle de poisson zèbre du diabète sucré et de la mémoire métabolique

Diabetes mellitus currently affects 346 million individuals and this is projected to increase to 400 million by 2030. Evidence from both the laboratory ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel haute résolution<em&gt; In vivo</em&gt; Technique d&#39;imagerie pour étudier la réponse dynamique des structures intracrâniennes à la croissance tumorale et de thérapeutique

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Un modèle de poisson zèbre possible de la maladie polykystique des reins: Knockdown de<em&gt; Wnt5a</em&gt; Causes kystes chez le poisson zèbre reins

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

En trois dimensions modèle de co-culture tumeur stromale-Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Isolated Hepatic Perfusion as a Treatment for Liver Metastases of Uveal Melanoma

Perfusion hépatique isolée comme un traitement pour les métastases hépatiques de mélanome uvéal

Isolated hepatic perfusion (IHP) is a procedure where the liver is surgically isolated and perfused with a high concentration of the chemotherapeutic ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Évaluation des leucocytes infiltrant les tumeurs sous-ensembles dans un Modèle de tumeur sous-cutanée

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...