Name: screening for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model
Uploaded: 2012-11-13T13:00:00
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Wir danken Dr. Leonard I. Zon in dessen Labor diese Techniken wurden ursprünglich entwickelt, Kristen Kwan und die späten Chi-Bin Chien für Geschenke von Plasmiden in dieser Arbeit verwendet; James Lister und David Raible für die Unterstützung bei Antikörper-Färbung und James Neiswender für die Mikroinjektion Video. Diese Arbeit wurde vom NIH R00AR056899-03 bis CJC finanziert

Ein. Screening für Melanom Onset Modifiers <ol><li> Erstellen Gateways Mitteleinstieg Klone durch PCR Amplifikation des Volllängen-offenen Leserahmen von Genen von Interesse (GOI) und Rekombinieren in pDONR 221 mit BP Clonase II (Invitrogen). Verwenden Multisite Gateway-Technologie (Invitrogen) zu rekombinieren p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit Nr. 302 p3E_SV40polyA 6 und miniCoopR 5 bis Genen von Interesse unter der mitfa Promotors Platz in der miniCoopR Vektor (Abbildung 1...

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	<li>Beroukhim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+somatic+copy-number+alteration+across+human+cancers.">The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers.</a> Nature. 463, 899-905 (2010).</li><li>Curtin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+sets+of+genetic+alterations+in+melanoma.">Distinct sets of genetic alterations in melanoma.</a> N. Engl. J. Med. 353, 2135-2147 (2005).</li><li>Lin, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+genomic+diversity+and+tumor+dependency+in+malignant+melanoma.">Modeling genomic diversity and tumor dependency in malignant melanoma.</a> Cancer Res. 68, 664-673 (2008).</li><li>Patton, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+mutations+are+sufficient+to+promote+nevi+formation+and+cooperate+with+p53+in+the+genesis+of+melanoma.">BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma.</a> Curr. Biol. 15, 249-254 (2005).</li><li>Ceol, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+methyltransferase+SETDB1+is+recurrently+amplified+in+melanoma+and+accelerates+its+onset.">The histone methyltransferase SETDB1 is recurrently amplified in melanoma and accelerates its onset.</a> Nature. 471, 513-517 (2011).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev. Dyn. 236, 3088-3099 (2007).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function.">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li><li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants.">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).</li></ol>

Die miniCoopR Methode ermöglicht die Expression von Genen von Interesse im Zebrafisch Melanozyten. Dieser Ansatz nutzt die Tatsache, dass der Zebrafisch mitfa Gen-Zelle autonom wirkt. Aus diesem Grund sind Melanozyten durch die geretteten miniCoopR Vektor um das bestimmte Minigen und jedes Gen von Interesse, auf die sie physisch gekoppelt ist, enthalten. Gerettet Melanozyten sind deutlich sichtbar und können bei Tieren, die als Einzel-Zell-Embryonen injiziert wurden erzielt werden. Eine angegebene Grad der Ch...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Gateway-Rekombination Reagenzien </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> miniCoopR </td><td></td><td></td><td> Referenz 5 </td></tr><tr><td> Mitfa Antikörper </td><td></td><td></td><td> Referenz 5 </td></tr><tr><td> FITC Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Labs </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> casper Zebrafisch </td><td></td><td></td><td> Referenz 9 </td></tr><tr><td> 701N 10 ul Spritze </td><td> Hamilton / Fisher </td><td> 14-824 </td><td> &amp;nbsp; </td></tr><tr><td> 40 uM Filter </td><td> BD Falcon / Fisher </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 26140079 </td><td></td></tr></tbody></table>

screening for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model

Genomic Studien der menschlichen Krebsarten haben eine Fülle von Informationen über die Gene, die in Tumoren 1,2,3 verändert werden erbracht. Eine Herausforderung, die aus diesen Studien ist, dass viele Gene verändert werden, und es kann schwierig sein, genetische Veränderungen, Tumorgenese aus, dass diejenigen entstanden zeitweilig während der Transformation fuhren zu unterscheiden. Um diesen Unterschied zu zeichnen ist es vorteilhaft, einen Assay, die quantitativ messen kann die Wirkung eines veränderten Gens auf Tumorinitiation und andere Prozesse, die Tumoren zu persistieren und verbreiten ermöglichen müssen. Hier präsentieren wir Ihnen eine schnelle Möglichkeit, eine große Anzahl von Kandidaten Melanom Modifikatoren im Zebrafisch mit einem autochthonen Tumormodell 4, Schritte zur Melanom Initiierung und Wartung umfasst screenen. Ein Schlüssel Reagenz in diesem Assay ist die miniCoopR Vektor, welche Paare eine Wildtyp-Kopie des mitfa Melanocyt Spezifikation Faktor an einen Gateway Rekombinationskassette in welche Kandidaten melAnomalien Gene 5 rekombiniert werden. Der Vektor weist eine miniCoopR mitfa rettende Minigen, der den Promoter, offenen Leserahmen und 3&#39;-untranslatierten Region des Wildtyp-mitfa Gen enthält. Es ermöglicht uns, Konstrukte mit voller Länge open reading frames von Kandidaten Melanom Modifikatoren. P53 (lf);; mitfa (lf) Zebrafischembryonen: Diese einzelnen Klone können dann in einzelne Zelle Tg (BRAF V600E mitfa) injiziert werden. Die miniCoopR Vektor wird von Tol2-vermittelte Transgenese 6 integriert und rettet Melanozyten. Weil sie physisch mit dem mitfa rettende Minigen gekoppelt sind, werden Kandidatengene gerettet Melanozyten, von denen einige zu transformieren und entwickeln sich zu Tumoren exprimiert. Die Wirkung eines Kandidatengens auf Melanom Initiierung und Melanomzelle Eigenschaften können unter Verwendung Melanom Überleben Kurven Invasionsassays, Antikörperfärbung und Transplantation Assays werden.

Ein-Zell-Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (lf); mitfa (lf) Zebrafischembryonen wurden mit dem Vektor, der die miniCoopR Melanom Onkogen SETDB1 5 oder EGFP, jeder unter der Kontrolle des Promotors mitfa injiziert. Embryonen mit Melanozyten Rettung wurden ausgewählt und reifen lässt. Bei 2 Monate alten Tieren mit Melanocyt Rettungs größer als 4 mm 2, wurden ausgewählt. Die Tiere wurden untersucht wöchentlich für Melanome. Tumorinzidenz Kurven für den Erwachsenen...

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Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Eine schnelle Weg zum Bildschirm für die Melanom-Modifikatoren mit einem Zebrafisch autochthonen Tumormodell vorgestellt. Es nutzt die miniCoopR Vektor, der zur Expression von Melanom-Kandidat Gene in Melanozyten ermöglicht. Verfahren zur Melanom Überleben Kurven, eine Invasion Assay, ein Protokoll für Antikörperfärbung Maßstab von Melanozyten und Melanomzellen eine Transplantation Assay erhalten werden beschrieben.

Screening für Melanom Modifiers mit einem Zebrafisch Autochthone Tumormodell

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Multi-Photonen-Imaging der Tumorzellinvasion in einem orthotopen Mausmodell des oralen Plattenepithelkarzinoms

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Forschung

Medizin

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Die Beurteilung Teratogene Änderungen in einem Zebrafisch-Modell der Fetal Alcohol Exposure

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Menschliche neuroendokrinen Tumor-Zelllinien als dreidimensionales Modell für das Studium der menschlichen neuroendokrinen Tumor-Therapie

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patienten abgeleitet Zellkultur und Isolierung von CD133<sup&gt; +</sup&gt; Mutmaßliche Cancer Stem Cells von Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory

Ein Zebrafisch Modell des Diabetes mellitus und Stoffwechselkrankheiten Speicher

Diabetes mellitus currently affects 346 million individuals and this is projected to increase to 400 million by 2030. Evidence from both the laboratory ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel Hochauflösende<em&gt; In vivo</em&gt; Bildtechnik, um die Dynamik der intrakranielle Strukturen zu Tumorwachstum und Therapeutics Studieren

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Eine mögliche Zebrafisch-Modell der Kidney Disease: Knockdown von<em&gt; Wnt5a</em&gt; Ursachen Zysten in Zebrafisch-Nieren

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Dreidimensionale Co-Kultur-Modell für Tumor-Stroma-Interaktion

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Isolated Hepatic Perfusion as a Treatment for Liver Metastases of Uveal Melanoma

Isolierte Leberperfusion als Behandlung für Lebermetastasen von Aderhautmelanom

Isolated hepatic perfusion (IHP) is a procedure where the liver is surgically isolated and perfused with a high concentration of the chemotherapeutic ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Bewertung der Tumor-infiltrierenden Leukozyten-Untergruppen in einer subkutanen Tumormodell

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...