Name: screening for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model
Uploaded: 2012-11-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model at JoVE.com

אנו מודים לד&quot;ר ליאונרד I. זון שבמעבדה שלו טכניקות אלו פותחו בתחילה; קריסטן קוואן ומאוחר צ&#39;י סל Chien למתנות של פלסמידים משמשים בעבודה זו; ג&#39;יימס ליסטר ודיוויד Raible לקבלת סיוע בצביעת נוגדנים, וג&#39;יימס לNeiswender וידאו microinjection. עבודה זו מומנה על ידי מענק NIH R00AR056899-03 לCJC

1. הקרנה למכפילי התחילה מלנומה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת שיבוטי כניסה אמצעית Gateway באמצעות PCR הגברת המסגרת באורך מלא הפתוחה קריאה של גנים של עניין (GOI) ויצרף אל pDONR 221 באמצעות BP clonase השני (Invitrogen). השתמש multisite Gateway טכנולוגיה (Invitrogen) לrecombine p5E_mitfa,...

<ol>
	<li>Beroukhim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+somatic+copy-number+alteration+across+human+cancers.">The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers.</a> Nature. 463, 899-905 (2010).</li><li>Curtin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+sets+of+genetic+alterations+in+melanoma.">Distinct sets of genetic alterations in melanoma.</a> N. Engl. J. Med. 353, 2135-2147 (2005).</li><li>Lin, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+genomic+diversity+and+tumor+dependency+in+malignant+melanoma.">Modeling genomic diversity and tumor dependency in malignant melanoma.</a> Cancer Res. 68, 664-673 (2008).</li><li>Patton, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+mutations+are+sufficient+to+promote+nevi+formation+and+cooperate+with+p53+in+the+genesis+of+melanoma.">BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma.</a> Curr. Biol. 15, 249-254 (2005).</li><li>Ceol, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+methyltransferase+SETDB1+is+recurrently+amplified+in+melanoma+and+accelerates+its+onset.">The histone methyltransferase SETDB1 is recurrently amplified in melanoma and accelerates its onset.</a> Nature. 471, 513-517 (2011).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev. Dyn. 236, 3088-3099 (2007).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function.">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li><li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants.">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).</li></ol>

שיטת miniCoopR מאפשרת ביטוי של גנים של עניין מלנוציטים דג זברה. גישה זו מנצלת את העובדה שגן mitfa דג הזברה פועל תא אוטונומי. מסיבה זו, מלנוציטים חולצו על ידי וקטור miniCoopR בטוחים כדי להכיל minigene וכל גן של עניין שאליו הוא מצמיד באופן פיזי. מלנוציטים הצילו הם נראים בבירור ונית...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> ריאגנטים רקומבינציה Gateway </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> miniCoopR </td><td></td><td></td><td> עיון 5 </td></tr><tr><td> נוגדן Mitfa </td><td></td><td></td><td> עיון 5 </td></tr><tr><td> עיזים נוגדני IgG נגד ארנב FITC </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> מעבדות וקטור </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> קספר דג זברה </td><td></td><td></td><td> התייחסות 9 </td></tr><tr><td> 701N 10 מזרק μl </td><td> המילטון / פישר </td><td> 14-824 </td><td> &amp;nbsp; </td></tr><tr><td> 40 מיקרומטר סינון </td><td> BD פלקון / פישר </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 26140079 </td><td></td></tr></tbody></table>

screening for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model

מחקרים הגנומי של סרטן האנושי הניבו שפע של מידע על גנים ששינו בגידולי 1,2,3. אתגר נובע ממחקרים אלה הוא שגנים רבים הם שינו, וזה יכול להיות קשה להבחין שינויים גנטיים שהובילו tumorigenesis מאלה שהתעוררו במקרה במהלך הפיכה. כדי לצייר הבחנה זו היא מועילה יש assay שיכול כמותית למדוד את ההשפעה של גן השתנה בייזום גידול ותהליכים אחרים שייאפשרו גידולים להתמיד ולהפיץ. כאן אנו מציגים אמצעי מהיר כדי לסנן כמויות גדולות של מלנומה מכפילי מועמד בדג זברה באמצעות 4 מודל גידול כבני מקום שמקיפים את פעולות הנדרשות לייזום מלנומה ותחזוקה. מגיב מפתח בassay זה הוא וקטור miniCoopR, שזוגות העתקה פרועה סוג של גורם מפרט מלנוציט mitfa לקלטת רקומבינציה שער שאליו מל המועמדגני anoma ניתן recombined 5. וקטור miniCoopR יש minigene הצלת mitfa המכיל מקדם, מסגרת קריאה פתוחה ואזור 3&#39;-מתורגם של גן mitfa פראי מהסוג. זה מאפשר לנו לבצע מבנים באמצעות מסגרות קריאה פתוחות באורך מלא של מלנומה מכפילי מועמד. שיבוטים בודדים אלה לאחר מכן ניתן להזריק לתוך תא Tg היחיד (mitfa: BRAF V600E); (LF) עוברי דג זברת mitfa; p53 (LF). וקטור miniCoopR מקבל משולב על ידי transgenesis Tol2 בתיווך 6 ומציל מלנוציטים. משום שהם מצמידים פיסיים mitfa הצלת minigene, גני המועמדים באים לידי הביטוי במלנוציטים חולצו, שחלקם יהפכו ולהתפתח לגידולים. ההשפעה של גן המועמד בייזום לנומה ומאפייני תא מלנומה ניתן למדוד באמצעות עקומות הישרדות ללא מלנומה, מבחני פלישה, מכתים נוגדן מבחני השתלה.

אחד תאי Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (LF); (LF) עוברי mitfa דג זברה הוזרקו וקטור miniCoopR מכיל אונקוגן לנום SETDB1 5 או EGFP, כל אחד תחת השליטה של אמרגן mitfa. עוברים בעלי הצלת מלנוציט נבחרו ואפשרו לבוגרים. ב2 חודשים של גיל עם הצלת חי מלנוציט יותר מ 4 מ&quot;מ 2 נבחרו. הח...

Watch this Scientific Journal Video about Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model at JoVE.com

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

דרך מהירה למסך למכפילים מלנומה תוך שימוש במודל גידול כבני מקום דג זברה מוצגת. הוא מנצל את וקטור miniCoopR המאפשר ביטוי של גנים מלנומה מועמד במלנוציטים. שיטה להשיג עקומות מלנומה ללא הישרדות, assay פלישה, פרוטוקול למכתים נוגדן של מלנוציטים קנה המידה וassay השתלה מלנומה מתוארת.

הקרנה למכפילים מלנומה תוך שימוש במודל גידול כבני מקום דג זברה

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Multi-פוטון הדמיה של הפלישה תאים סרטניים במודל עכבר orthotopic של קרצינומה של תאים קשקשיים אוראלי

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

הערכת שינויים teratogenic במודל דג הזברה של חשיפה אלכוהול עוברית

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

האדם תאים סרטניים נוירואנדוקריניים קווים כמו מודל תלת ממדי לחקר הטיפול האנושי גידול נוירואנדוקריניים

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

תרבות מטופל נגזר סלולרי ובידוד של CD133<sup&gt; +</sup&gt; תאי גזע סרטני משוערים מלנומה

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory

דגם דג זברה של סוכרת וזכרון מטבולית

Diabetes mellitus currently affects 346 million individuals and this is projected to increase to 400 million by 2030. Evidence from both the laboratory ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

רומן ברזולוציה גבוהה<em&gt; בvivo</em&gt; טכניקת הדמיה כדי לחקור את התגובה דינמית של מבנים תוך גולגולתי לצמיחה גידול וTherapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

מודל אפשרי דג הזברה של מחלת כליות פוליציסטיות: מציאה של<em&gt; Wnt5a</em&gt; גורם ציסטות בכליות דג הזברה

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

מודל שיתוף תרבות תלת-ממדי לגידול אינטראקציה-סטרומה

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Isolated Hepatic Perfusion as a Treatment for Liver Metastases of Uveal Melanoma

כבדית זלוף המבודד לטיפול בכבד גרורות של מלנומה של הענביה

Isolated hepatic perfusion (IHP) is a procedure where the liver is surgically isolated and perfused with a high concentration of the chemotherapeutic ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

הערכה של תת-יקוציט חדירת גידול בדגם גידול תת עורי

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...