Name: screening for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model
Uploaded: 2012-11-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model at JoVE.com

Vi tackar Dr Leonard I. Zon i vars laboratorium dessa tekniker ursprungligen utvecklades, Kristen Kwan och den sena Chi-Bin Chien för gåvor av plasmider som används i detta arbete, James Lister och David Raible för hjälp med antikroppar färgning, och James Neiswender för mikroinjektion videon. Detta arbete har finansierats av NIH bidrag R00AR056899-03 till CJC

1. Screening för Modifieringar Melanom Onset <ol><li> Skapa Gateway-kloner mitten inträde med PCR förstärka fullängds öppna läsramen av gener av intresse (GOI) och rekombination in pDONR 221 med BP CLONASE II (Invitrogen). Använd flera platser Gateway teknik (Invitrogen) till rekombinera p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit # 302 p3E_SV40polyA 6 och miniCoopR 5 för att placera gener av intresse under mitfa promotorn i miniCoopR vektorn (Figur 1A). </li><li> Inji...

<ol>
	<li>Beroukhim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+somatic+copy-number+alteration+across+human+cancers.">The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers.</a> Nature. 463, 899-905 (2010).</li><li>Curtin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+sets+of+genetic+alterations+in+melanoma.">Distinct sets of genetic alterations in melanoma.</a> N. Engl. J. Med. 353, 2135-2147 (2005).</li><li>Lin, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+genomic+diversity+and+tumor+dependency+in+malignant+melanoma.">Modeling genomic diversity and tumor dependency in malignant melanoma.</a> Cancer Res. 68, 664-673 (2008).</li><li>Patton, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+mutations+are+sufficient+to+promote+nevi+formation+and+cooperate+with+p53+in+the+genesis+of+melanoma.">BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma.</a> Curr. Biol. 15, 249-254 (2005).</li><li>Ceol, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+methyltransferase+SETDB1+is+recurrently+amplified+in+melanoma+and+accelerates+its+onset.">The histone methyltransferase SETDB1 is recurrently amplified in melanoma and accelerates its onset.</a> Nature. 471, 513-517 (2011).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev. Dyn. 236, 3088-3099 (2007).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function.">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li><li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants.">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).</li></ol>

Den miniCoopR Metoden möjliggör uttryck av gener av intresse i zebrafisk melanocyter. Detta tillvägagångssätt drar fördel av det faktum att zebrafisk mitfa genen fungerar cell-autonomt. Av denna anledning, melanocyter räddas av miniCoopR vektorn är säker på att innehålla minigenen och varje gen av intresse till vilken den är fysiskt kopplad. Räddade melanocyter är klart synliga och kan erhållas i djur som injicerades som encelliga embryon. En specificerad grad av chimerism väljs och djur övertr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Gateway rekombinations reagenser </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> miniCoopR </td><td></td><td></td><td> Referens 5 </td></tr><tr><td> Mitfa antikropp </td><td></td><td></td><td> Referens 5 </td></tr><tr><td> FITC get-anti-kanin-IgG-antikropp </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Labs </td><td> ^ H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> casper Zebrafish </td><td></td><td></td><td> Referens 9 </td></tr><tr><td> 701N 10 pl Syringe </td><td> Hamilton / Fisher </td><td> 14-824 </td><td> &amp;nbsp; </td></tr><tr><td> 40 iM filter </td><td> BD Falcon / Fisher </td><td> 352.340 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 26140079 </td><td></td></tr></tbody></table>

screening for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model

Genomiska studier av cancer hos människa har gett en mängd information om gener som är förändrade i tumörer 1,2,3. En utmaning som härrör från dessa studier är att många gener förändras, och det kan vara svårt att skilja genetiska förändringar som drev tumörgenes från att de uppstod för övrigt under förändring. Att dra denna distinktion är det fördelaktigt att ha en analys som kvantitativt kan mäta effekten av en förändrad gen på tumörinitiering och andra processer som möjliggör tumörer att kvarstå och sprida. Här presenterar vi en snabb sätt att screena ett stort antal modifierare kandidat melanom i zebrafisk med ett autoktont 4 tumör modell som omfattar steg som krävs för melanom initiering och underhåll. En viktig reagens i denna analys är miniCoopR vektorn, som kopplar en vild-typ kopia av mitfa melanocyt specifikationen faktor till en gateway rekombination kassett i vilken kandidat melAnoma gener kan rekombineras 5. Den miniCoopR vektorn har en mitfa rädda minigen som innehåller promotorn, öppna läsramen och 3&#39;-otranslaterade regionen av vildtyp mitfa genen. Det ger oss möjlighet att göra konstruktioner som använder full längd öppna läsramar av modifierare kandidat melanom. Dessa enskilda kloner kan sedan injiceras i en enda cell Tg (mitfa: BRAF V600E), p53 (LF), mitfa (LF) zebrafisk embryon. Den miniCoopR vektorn blir integrerat med Tol2-medierad transgenes 6 och räddar melanocyter. Eftersom de är fysiskt kopplade till mitfa rädda minigenen, är kandidatgener uttrycks i melanocyter räddade, av vilka vissa kommer att förvandla och utvecklas till tumörer. Effekten av en kandidat gen på melanom initiering och melanom cellegenskaper kan mätas med hjälp melanom överlevnad kurvor, analyser invasion, antikroppar färgning och analyser transplantation.

En-cell-Tg (mitfa: BRAF V600E), p53 (LF), mitfa (LF) zebrafisk embryon injicerades med miniCoopR vektorn innehållande melanom onkogenen SETDB1 5 eller EGFP, vardera under kontroll av promotorn mitfa. Embryon med melanocyt räddning valdes och fick mogna. Vid 2 månaders ålder djur med melanocyt räddning större än 4 mm 2 valdes. Djuren screenades veckovis för melanom. Tumörincidens kurvor för vuxna visade att SETDB1 onkogenen signifikant accelerer...

Watch this Scientific Journal Video about Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model at JoVE.com

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Ett snabbt sätt att screena för melanom modifierare med en zebrafisk autoktona tumörmodell presenteras. Det drar fördel av miniCoopR vektor som tillåter uttryck av gener kandidat melanom i melanocyterna. En metod för att få melanom överlevnad kurvor, en invasion assay, ett protokoll för antikroppar färgning av skala melanocyter och en melanom transplantation analys beskrivs.

Screening för melanom Modifieringar med en Zebrafish Autoktont tumörmodell

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Multi-photon avbildning av tumörcellen invasion i ett Orthotopic musmodell av oral skivepitelcancer

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Bedömning Teratogena Förändringar i ett Zebrafish modell av Fetal Alcohol Exponering

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Mänskliga neuroendokrin tumör cellinjer som en tredimensionell modell för studiet av mänskliga neuroendokrin tumör Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture och isolering av CD133<sup&gt; +</sup&gt; Förmodade Cancer stamceller från melanom

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory

En Zebrafish modell av diabetes mellitus och metabola Memory

Diabetes mellitus currently affects 346 million individuals and this is projected to increase to 400 million by 2030. Evidence from both the laboratory ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel Högupplöst<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging teknik för att studera dynamiska svaret för intrakraniell Structures till tumörtillväxt och Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

En möjlig Zebrafish Modell av polycystisk njursjukdom: Knockdown av<em&gt; Wnt5a</em&gt; Orsaker Cystor i Zebrafish Njurar

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Tredimensionell Samodling modell för Tumör-stromal Interaktion

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Isolated Hepatic Perfusion as a Treatment for Liver Metastases of Uveal Melanoma

Isolerade lever Perfusion som behandling för levermetastaser av Uveal Melanom

Isolated hepatic perfusion (IHP) is a procedure where the liver is surgically isolated and perfused with a high concentration of the chemotherapeutic ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Utvärdering av tumörinfiltrerande Leukocyte Subsets i en subkutan tumör Model

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...