Name: continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast
Uploaded: 2013-08-20T13:00:00
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우리는 미토콘드리아 형태학을 기록 세포 로딩 프로토콜과 마커스 드 Goffau 및 인 Guille Zampar의 첫 번째 버전을 작성하기위한 로라 Schippers에게 감사의 말씀을 전합니다.

1. 실리콘 웨이퍼 금형의 생산 및 준비 마이크로 유체 칩은 소프트 리소그래피에 의해 생성 된 실리콘 웨이퍼 형에서 만들어집니다. 이 웨이퍼는 마이크로 유체 칩을 생산하기 위해 여러 번 재사용 할 수 있습니다. 그것은 각각의 웨이퍼 생산 미세 유체 6 전문 그룹에 의해 수행되는 것이 바람직하다. 웨이퍼 네거티브 포토 레지스트의 두 가지 층, ...

<ol>
	<li>Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+yeast+to+discover+the+fountain+of+youth.">Using yeast to discover the fountain of youth.</a> Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1 (2001).</li><li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+span+of+individual+yeast+cells.">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).</li><li>Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+replicative+life+span+in+the+budding+yeast.">Measuring replicative life span in the budding yeast.</a> J. Vis. Exp. (28), e1209 (2009).</li><li>Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform.">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 4916-4920 (2012).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phenotyping+of+aging+in+single+yeast+cells+using+a+novel+microfluidic+device.">Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device.</a> Aging Cell. , (2012).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Angewandte Chemie International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).</li><li>Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+multi-layer+SU-8+microstructures.">Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).</li><li>Huang, Y., Agrawal, B., Clark, P. A., Williams, J. C., Kuo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cancer+stem+cell+migration+using+compartmentalizing+microfluidic+devices+and+live+cell+imaging.">Evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging.</a> J. Vis. Exp. (58), e3297 (2011).</li><li>Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+determining+yeast+replicative+life+span+in+a+long-lived+genetic+background.">Genes determining yeast replicative life span in a long-lived genetic background.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 126 (4), 491-504 (2005).</li><li>Scheckhuber, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+mitochondrial+fission+results+in+increased+life+span+and+fitness+of+two+fungal+ageing+models.">Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models.</a> Nat. Cell Biol. 9 (1), 99-105 (2007).</li><li>Defossez, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+replication+block+protein+Fob1+extends+the+life+span+of+yeast+mother+cells.">Elimination of replication block protein Fob1 extends the life span of yeast mother cells.</a> Mol. Cell. 3 (4), 447-455 (1999).</li><li>Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SIR2/3/4+complex+and+SIR2+alone+promote+longevity+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+two+different+mechanisms.">The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms.</a> Genes Dev. 13 (19), 2570-2580 (1999).</li><li>Shcheprova, Z., Baldi, S., Frei, S. B., Gonnet, G., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+asymmetric+segregation+of+age+during+yeast+budding.">A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding.</a> Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).</li><li>Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+heterogeneity+in+populations+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).</li><li>Huh, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+localization+in+budding+yeast.">Global analysis of protein localization in budding yeast.</a> Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).</li><li>Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+new+generation+of+microfluidic+device.">Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device.</a> PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).</li></ol>

여기에 설명 된 미세 메서드는 지속적으로 높은 해상도 이미지와 함께 효모 증식하는 수명 데이터를 간단하고 자동 생성을 가능으로 노화 연구에 중요한 새로운 도구입니다. 이러한 특성은 고전적인 절개 방법의 실험 가능성에 큰 개선이다, 그러나 고려해야하는 방법의 몇 가지 제한이 있습니다. micropad에서 보관 모든 셀 (이웃 세포의 신진 셀 예를 들어 그것을 멀리 ?...

효모 신진은 연구 1 노화에 대한 중요한 모델 생물이다. 최근 효모 세포 노화 증식하는 공부를 할 때까지 각각의 봉오리를 수동으로 어머니 세포 2,3에서 제거하는, 해부 방법을 필요로하는 힘든 과정이었다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 최근 자신의 전체 수명 4를 통해 각각의 어머니 세포를 추적 할 새로운 마이크로 유체 설치를 발표했다. 우리의 마이크로 유체 칩, 효모 세포는 (그림 1 참조) 부드러운 탄성 중합체 기반 micropads 아래에 갇혀있다. 매체의 지속적인 흐름이 떨어져 새로 형성 딸 세포를 세척하고 신선한 영양소와 세포를 제공합니다. 한 실험에서 50까지 어머니 세포는 그들의 전체 증식하는 수명에 걸쳐 완전 자동화 된 방식으로 모니터링 할 수 있습니다. 미세 유체 칩의 우수한 광학 특성으로 인해, 그것은 동시에 효모 세포 생물학의 다양한 측면 (예를 들어 모니터링 할 수 있습니다 </EM&gt; 형광 단백질)를 사용하여. 고전적인 절개 방법에 비해 미세 설정은 상당한 이점을 제공합니다. 그것은 전체 노화 실험 기간 동안 정의 및 지속적인 환경을 보장합니다. 그것은 고가의 전문 장비를 필요로하지 않고 자동 초점과 시간 경과 능력을 가지고뿐만 아니라 온도 제어 세포 재배되어 어떤 현미경에서 실행할 수 있습니다. 미세 유체 칩의 생산 작업은 몇 일 이내에 배울 수 있습니다. 또한, 세포는 주로 기하 급수적으로 증가 문화, 어머니 세포의 biotinylation을 필요로하는 다른 최근 발표 된 미세 방법 5에 비해 이점에서로드 할 수 있습니다.은 여기에 설명 된 방법은 점진적인 변화를 측정하는 데 사용할 수있는 고해상도 이미지와 결합 세포 형태에서, 효모 동안 단백질 발현 및 현지화은 전례없는 방식으로 노화. 의 기능단일 세포의 장기 모니터링은 또한 효모 세포주기 연구에 대한 독특한 가능성을 제공합니다. 이 방법은 최근에이 원고 검토에있는 동안 출판 된 프로토콜 16에서 biotinylation을 제거하는 최적화되었습니다.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name </td>
 <td>Company </td>
 <td>Catalogue number </td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DC Sylgard 184 elastomer </td>
 <td>Mavom bv </td>
 <td>1060040 </td>
 <td>This package contains PDMS base and PDMS curing agent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass Petri dishes 120/20 mm </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>391-2850 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cover glasses 22x40 mm </td>
 <td>CBN Labsuppliers BV </td>
 <td>190002240 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tough-Tags </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>Z359106 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aluminum foil </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic disposable cup </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Serological pipette 5 ml </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>612-1245 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scotch tape </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>819-1460 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Baysilone paste (GE Bayer silicones) </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>85403-1EA </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PTFE microbore tubing, 0.012"ID x 0.030"OD </td>
 <td>Cole Parmer </td>
 <td>EW-06417-11 </td>
 <td>Referred to as thin tubing </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tygon microbore Tubing, 0.030"ID x 0.090"OD </td>
 <td>Cole Parmer </td>
 <td>EW-06418-03 </td>
 <td>Referred to as thick tubing </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scalpel </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>233-5334 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml Luer-Lok syringes </td>
 <td>BD </td>
 <td>300137 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml syringes, Luer tip </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>613-1599 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tweezers </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>232-2132 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20 Gauge Luer stubs </td>
 <td>Instech Solomon </td>
 <td>LS20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe filters (pore size 0.20 &mu;m) </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>16534K </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm </td>
 <td>Instech Solomon </td>
 <td>SP20/12 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petri dishes </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>391-0892 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td> EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Benchtop UV-Ozone Cleaner </td>
 <td>NOVA Scan </td>
 <td>PSD-UVT </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Harvard Pump 11 Elite </td>
 <td>Harvard Apparatus </td>
 <td>70-4505 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SU-8 silicon master mold (wafer) </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Self-made; For details contact corresponding author </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Balance </td>
 <td>Sartorius corporation </td>
 <td>ED4202S </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vacuum pump </td>
 <td>KNF Neuberger </td>
 <td>N022 AN.18 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Desiccator </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>467-2115 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hot plate </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>460-3267 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optional: Metal holder for cover glass (22x40 mm) </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Self-made; For details contact corresponding author </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage </td>
 <td>Nikon </td>
 <td>Eclipse Ti-E </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast

우리는 단 하나 싹 트는 효모 세포가 자신의 전체 수명에 걸쳐 추적 할 수있는 간단한 미세 설정의 사용을 보여줍니다. 미세 유체 칩은 micropads의 배열을 사용하여 어머니와 딸 세포 사이의 크기 차이를 이용합니다. micropad 및 커버 유리 사이의 거리가 효모 세포 (3-4 μm의)의 직경과 비슷하기 때문에로드 할 때, 세포는, 이러한 micropads 아래에 갇혀있다. 로딩 과정을 거친 후, 배양액을 연속적으로 그들의 작은 크기로 인해 패드 아래에 유지되지 않습니다 새로운 딸 세포 밖으로 플러시 또한 전체 실험을하는 동안 상수 정의 환경을 만들어뿐만 아니라 칩을 통해 플러시되지만. 설정은 하나의 실험에서 50까지 각각의 세포가 더 필요한 경우 5 일 동안 완전 자동화 된 방식으로 모니터링하거나 할 수 있도록 효율적으로 어머니 세포를 유지합니다. 또한, 칩의 우수한 광학 특성은 높은 수전체 노화 과정에서 세포의 고해상도 영상.

이 프로토콜에서는, 세포는 주로 중간 지수 문화 미세 유체 칩에로드됩니다. 미세 유체 칩에 갇혀 세포의 연령 분포가로드되기 전에 문화의 그것과 유사 여부를 확인하기 위해, 세포 봉오리 상처를 시각화하는 FITC에 복합 밀 agglutinin을 (WGA-FITC)로 염색 하였다. 그림 3에서 볼 수 있듯이, 미세 유체 칩의 micropads에 따라 세포의 함정 수사는 특정 연령의 세포에 편향되지 않습니다. <p cla...

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Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

우리는 여기에서 자신의 완전한 증식하는 및 / 또는 연대순 수명 기간 동안 하나의 신진 효모 세포의 연속 고해상도 현미경 이미징을 허용 microfluidic 장치의 동작을 설명합니다.

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