Name: continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast
Uploaded: 2013-08-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Laura Schippers for å skrive de første versjonene av cellen lasting protokollen og Marcus de Goffau og Guille Zampar for å utføre mitokondrielle morfologi.

En. Produksjon og klargjøring av en Silicon Wafer Mold Microfluidic chips er laget av en silisium wafer mold produsert av myk litografi. Disse wafere kan brukes om igjen mange ganger for å produsere microfluidic chips. Det er tilrådelig at produksjonen av en respektiv skive er utført av en gruppe spesialisert på MicroFluidics 6.. Skiven er laget i en to-trinns prosess ved hjelp av fotolitografi to forskjellige lag av negativ fotoresist, SU-8 7....

<ol>
	<li>Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+yeast+to+discover+the+fountain+of+youth.">Using yeast to discover the fountain of youth.</a> Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1 (2001).</li><li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+span+of+individual+yeast+cells.">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).</li><li>Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+replicative+life+span+in+the+budding+yeast.">Measuring replicative life span in the budding yeast.</a> J. Vis. Exp. (28), e1209 (2009).</li><li>Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform.">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 4916-4920 (2012).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phenotyping+of+aging+in+single+yeast+cells+using+a+novel+microfluidic+device.">Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device.</a> Aging Cell. , (2012).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Angewandte Chemie International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).</li><li>Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+multi-layer+SU-8+microstructures.">Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).</li><li>Huang, Y., Agrawal, B., Clark, P. A., Williams, J. C., Kuo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cancer+stem+cell+migration+using+compartmentalizing+microfluidic+devices+and+live+cell+imaging.">Evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging.</a> J. Vis. Exp. (58), e3297 (2011).</li><li>Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+determining+yeast+replicative+life+span+in+a+long-lived+genetic+background.">Genes determining yeast replicative life span in a long-lived genetic background.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 126 (4), 491-504 (2005).</li><li>Scheckhuber, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+mitochondrial+fission+results+in+increased+life+span+and+fitness+of+two+fungal+ageing+models.">Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models.</a> Nat. Cell Biol. 9 (1), 99-105 (2007).</li><li>Defossez, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+replication+block+protein+Fob1+extends+the+life+span+of+yeast+mother+cells.">Elimination of replication block protein Fob1 extends the life span of yeast mother cells.</a> Mol. Cell. 3 (4), 447-455 (1999).</li><li>Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SIR2/3/4+complex+and+SIR2+alone+promote+longevity+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+two+different+mechanisms.">The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms.</a> Genes Dev. 13 (19), 2570-2580 (1999).</li><li>Shcheprova, Z., Baldi, S., Frei, S. B., Gonnet, G., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+asymmetric+segregation+of+age+during+yeast+budding.">A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding.</a> Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).</li><li>Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+heterogeneity+in+populations+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).</li><li>Huh, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+localization+in+budding+yeast.">Global analysis of protein localization in budding yeast.</a> Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).</li><li>Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+new+generation+of+microfluidic+device.">Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device.</a> PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).</li></ol>

Microfluidic metoden som beskrives her er en viktig roman verktøy i aldring forskning som det muliggjør enkel og automatisk generering av gjær replicative levetid data i kombinasjon med kontinuerlig høy oppløsning. Disse egenskapene er viktige forbedringer over de eksperimentelle muligheter for den klassiske disseksjon metoden, men det er noen begrensninger i metode som må tas i betraktning. Merk at fastsatt replicative levetid kan påvirkes av effektiviteten til oppbevaring av mor cel...

Spirende gjær er en viktig modell organisme for aldring forskning en. Inntil nylig studere replikative aldring i gjærceller var en arbeidskrevende prosess som krever en disseksjon metoden, hvor hver knopp ble manuelt fjernet fra morcellen 2,3. For å løse dette problemet, vi nylig presentert en ny microfluidic oppsett i stand til å spore individuelle mor celler gjennom hele sin levetid fire. I vår microfluidic chip, er gjærceller fanget under myke elastomer-baserte micropads (se figur 1). En kontinuerlig strøm av medium vasker bort nydannede datterceller og gir cellene med friske næringsstoffer. I et enkelt eksperiment, kan opptil 50 mor celler bli overvåket på en helautomatisk måte gjennom hele replicative levetid. På grunn av de gode optiske egenskaper mikrofluidteknisk brikke, er det mulig å samtidig overvåke forskjellige aspekter av gjær cellebiologi (f.eks </em&gt; ved hjelp av fluoriserende proteiner). Sammenlignet med den klassiske disseksjon metoden gir microfluidic oppsett betydelige fordeler. Det sikrer et definert og konstant miljø under hele aldring eksperimentet. Det krever ingen dyre spesialisert utstyr og kan kjøres på alle mikroskop utstyrt med automatisk fokus og time-lapse evner samt temperatur-kontroll for celle dyrking. Produksjon og drift av microfluidic chips kan læres i løpet av få dager. I tillegg kan cellene være direkte lastet fra en eksponensielt voksende kultur, en fordel fremfor en annen nylig publisert metode mikrofluidteknisk 5, som krever biotinylering av mor-celler. Kombinert med en høy oppløsning avbildning, den her beskrevne fremgangsmåte kan brukes til å måle gradvise endringer i mobilnettet morfologi, protein uttrykk og lokalisering under gjær aldring på en enestående måte. Muligheten forlangsiktig overvåking av enkeltceller gir også unike muligheter for gjær cellesyklus studier. en Denne metoden har nylig blitt optimalisert for å fjerne biotinylering fra 16-protokollen, som ble publisert mens dette manuskriptet var i gjennomgang.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name </td>
 <td>Company </td>
 <td>Catalogue number </td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DC Sylgard 184 elastomer </td>
 <td>Mavom bv </td>
 <td>1060040 </td>
 <td>This package contains PDMS base and PDMS curing agent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass Petri dishes 120/20 mm </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>391-2850 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cover glasses 22x40 mm </td>
 <td>CBN Labsuppliers BV </td>
 <td>190002240 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tough-Tags </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>Z359106 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aluminum foil </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic disposable cup </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Serological pipette 5 ml </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>612-1245 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scotch tape </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>819-1460 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Baysilone paste (GE Bayer silicones) </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>85403-1EA </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PTFE microbore tubing, 0.012"ID x 0.030"OD </td>
 <td>Cole Parmer </td>
 <td>EW-06417-11 </td>
 <td>Referred to as thin tubing </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tygon microbore Tubing, 0.030"ID x 0.090"OD </td>
 <td>Cole Parmer </td>
 <td>EW-06418-03 </td>
 <td>Referred to as thick tubing </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scalpel </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>233-5334 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml Luer-Lok syringes </td>
 <td>BD </td>
 <td>300137 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml syringes, Luer tip </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>613-1599 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tweezers </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>232-2132 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20 Gauge Luer stubs </td>
 <td>Instech Solomon </td>
 <td>LS20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe filters (pore size 0.20 &mu;m) </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>16534K </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm </td>
 <td>Instech Solomon </td>
 <td>SP20/12 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petri dishes </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>391-0892 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td> EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Benchtop UV-Ozone Cleaner </td>
 <td>NOVA Scan </td>
 <td>PSD-UVT </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Harvard Pump 11 Elite </td>
 <td>Harvard Apparatus </td>
 <td>70-4505 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SU-8 silicon master mold (wafer) </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Self-made; For details contact corresponding author </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Balance </td>
 <td>Sartorius corporation </td>
 <td>ED4202S </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vacuum pump </td>
 <td>KNF Neuberger </td>
 <td>N022 AN.18 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Desiccator </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>467-2115 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hot plate </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>460-3267 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optional: Metal holder for cover glass (22x40 mm) </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Self-made; For details contact corresponding author </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage </td>
 <td>Nikon </td>
 <td>Eclipse Ti-E </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast

Vi demonstrerer bruken av en enkel mikrofluidteknisk oppsett, hvor enkelt-spirende gjærceller kan spores gjennom hele sin levetid. Microfluidic chip utnytter størrelsen forskjellen mellom mor og datter celler ved hjelp av en rekke micropads. Ved lasting blir celler fanget under disse micropads, fordi avstanden mellom micropad og dekkglass er lik diameteren av en gjær-celle (3-4 um). Etter lastingen prosedyren, er dyrkningsmedium kontinuerlig spylt gjennom brikken, noe som ikke bare skaper en konstant og definert miljø gjennom hele forsøket, men også spyler ut de fremvoksende datterceller som ikke beholdes under elektrodene på grunn av deres mindre størrelse. Oppsettet beholder mor celler så effektivt at det i et enkelt eksperiment opp til 50 individuelle celler kan overvåkes på en helautomatisk måte i 5 dager, eller, om nødvendig, lengre. I tillegg er de utmerkede optiske egenskaper brikken tillater høy-Oppløsning avbildning av celler under hele aldringsprosessen.

I denne protokollen, er celler lastet inn i microfluidic chip direkte fra midten av eksponentiell kultur. Å fastslå om aldersfordelingen av celler fanget i microfluidic chip er lik som den kulturen før lasting, ble cellene farget med hvete agglutinin konjugert til FITC (WGA-FITC) for å visualisere knopp arr. Som kan sees i figur 3, er innlagring av celler under micropads av mikrofluidteknisk brikken ikke forspent til celler av en viss alder. Replikative levetid kan gansk...

Watch this Scientific Journal Video about Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast at JoVE.com

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

Vi beskriver her driften av en microfluidic enhet som tillater kontinuerlig og høy oppløsning mikroskopisk avbildning av single spirende gjærceller under deres komplette replicative og / eller kronologisk levetid.

Kontinuerlig høy oppløsning Mikroskopisk Observasjon av replicative Aldring i Spirende Gjær

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Høyoppløselig Spatiotemporal Analyse av Receptor Dynamics av ​​Single-molekyl fluorescens mikroskopi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Utarbeidelse av Mica Støttet Lipid bilayers for High Resolution Optical Mikros Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

Nutrient Regulering av Kontinuerlig Fôring for storstilt utvidelse av pattedyrceller i Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

Riktig posisjonering og beherskelse av en rotte Hind lem ved fokusert høyoppløselig avbildning av bein mikroarkitektur bruker i Vivo mikro-beregnet tomografi

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Høyoppløselig 3D-bildebehandling av menneskelig bukspyttkjertelen Nevro-isolerte nettverket

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

High-resolution Patterning Using Two Modes of Electrohydrodynamic Jet: Drop on Demand and Near-field Electrospinning

Høyoppløselig mønstre ved hjelp av to driftsmoduser Electrohydrodynamic Jet: slipp på etterspørsel og nær-feltet Electrospinning

Electrohydrodynamic (EHD) jet printing has drawn attention in various fields because it can be used as a high-resolution and low-cost direct patterning ...

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

Høyoppløselig mønstret Biofilm deponering bruker pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Høyoppløselig bilde av Nuclear Dynamics i levende celler under Uniaxial strekk belastning

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...