Name: telomere length and telomerase activity; a yin and yang of cell senescence
Uploaded: 2013-05-22T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence at JoVE.com

1. Протокол теломер Длина 19 <ol><li> Выделение ДНК </li></ol> Большинство методов выделения ДНК может быть использован. Наша лаборатория предпочитает Qiagen DNeasy Kit (# 69506) для крови источников. В зависимости от источника ДНК, например, буккального или других источников, другой спо...

Длина теломер предоставляет уникальный клеточный маркер для изучения напряженно и старения клеток и предлагает взглянуть на механизмы старения. Так как его роль в старении впервые было предложено, множество исследований было сделано, касающиеся длины теломеров с возрастом, долголет?...

Теломеры повторяющиеся ДНК гексамер (TTAGGG) последовательности, найденные на концах хромосом. В каждой клетке репликации, эти концы хромосом укорачиваются. Если они становятся слишком короткими, хромосомы могут подвергаться теломер слияний конца, аберрантными рекомбинации и деградации. Таким образом достаточную длину теломер обслуживания играет важную роль в обеспечении стабильности хромосом и клеточной защиты 38. Длина теломер также имеет решающее значение для генов, найденных вблизи концов хромосом, так как репликация ДНК не может продолжаться до самого конца хромосом 1-2. Следовательно, предотвращение укорочения теломер клетка может улучшить стабильность. Многочисленные исследования показали, что длина теломер коррелирует с долговечность организма и болезненное состояние, например, в 3-4 рак, диабет 5, а также сердечно-сосудистые заболевания 6,7. Кроме того, укороченные теломеры были связаны с чрезмерным напряжением илинездоровый образ жизни 8, возможно, путем поощрения преждевременного старения и гибели клеток 9. С другой стороны, некоторые исследования показали, что нет никакой существенной разницы между длиной теломер и долголетием и возрастных заболеваний связаны 39, 40, 41. Один из врожденные механизмы клетки защиты от укорочение теломер является путем активации фермента своя теломеразы обратной транскриптазы (трет). Этот фермент и его субъединицы теломеразы РНК (TERC), некодирующих РНК, используйте теломер в качестве шаблона для добавления теломер повторений, чтобы концы хромосом 10. Хотя активность теломеразы отсутствует из нескольких типов клеток и других механизмов, которые участвуют в поддержании теломер длину, увеличение теломеразной активности коррелирует с увеличением длины теломеры. Активация теломеразы было установлено как один из механизмов, посредством которых клетки реагируют на повреждения и стресс и предотвратить преждевременное старение и смерть. Например, те большеlomeres были продемонстрированы в популяции евреев-ашкенази с исключительной продолжительностью жизни 11, мутации в TERC или трет было показано, что вклад в смертельной болезни 12 и эпигенетической регуляции теломеразы как было показано, влияют на возрастных заболеваний 13. С момента своего открытия, длина теломер была предложена в качестве биомаркеров для состояния здоровья в различных животных моделях, а также у людей, но эти ранние исследования были широко трудно повторить, потому что был использован способ утомительно, долго и дорого. В 2002 году и в дальнейшем настроены в 2009 году, Cawthon предложены и продемонстрировали новый, точный, быстрый и простой протокол на основе ПЦР для оценки длины теломеров и дальнейшего изучения его роли в различных аспектах клеточной биологии, старение и болезни 19. Выбор правильного метод измерения теломер для исследования имеет важное значение. В настоящее время существуют различные методы, используемые для измерения длины теломеров, каждый со своим собственнымпреимущества и недостатки. Традиционно, длина теломер измеряется с помощью блот-анализе фрагментов терминал ограничения (ПВР), которая включает в себя:. переваривание ДНК ферментами рестрикции, что не режут теломер повторяется для получения TRFs, б. Саузерн-блот этих TRFs делается путем определения средней длины TRF помощью теломер зонд 14, 37. Хотя этот метод очень точно с малым коэффициентом вариации, является непосредственной мерой, и может быть выгодным для измерения длины распределения, TRF анализ является дорогостоящим, трудоемким и требует, по крайней мере, 3 мкг ДНК. Этот метод также нечувствительно к короткие теломеры и определения длины можно смешивать по субтеломерных ДНК, которые могут быть обнаружены с помощью зонда связи (TTAGGG) н подобные последовательности они содержат 15, 42. Другой очень точный метод измерения длины теломер Одноместный теломер длина анализа удлинение (STELA), синглэлектронной молекулы на основе ПЦР методом, который требует лишь небольшого количества ДНК. В этом методе праймеры, чтобы признать G-богатые выступ в конце хромосом и связывается с уникальным субтеломерных последовательности на одной хромосомы, который усиливает теломер конкретной хромосоме. В результате усиления затем визуализируется Саузерн-блоттинга. Этот метод имеет то преимущество, что высокой точностью и способен обнаруживать короткие теломеры выброса 16. К сожалению, поскольку не все хромосомы имеют G-богатые концах и полезной субтеломерных последовательность, длина теломер можно измерить только на конкретных хромосом и эти измерения не могут представлять длина всех теломеры в клетке 15. Другой метод, который практикуется является использование пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК) зондов для обнаружения длины теломеры. Количественные Florescence в гибридизация (Q-FISH) позволяет визуализировать теломер во время метафазы, где йAining теломер с зондом PNA пропорционально их размер позволяет сравнение между конкретными теломеры хромосом. Хотя этот метод также может быть использован для клеток в интерфазе, вот длину теломер хромосом для разных не могут быть обнаружены, которая вводит ограничения при измерении длины теломеров в стареющих или редко делящиеся клетки 17. Поток рыбу вместо проточной цитометрии используется и в настоящее время является наиболее чувствительным методом для измерения длины теломеры клеток крови в клинических условиях, но требует высокой квалификации техников 18. В настоящее время стандартного метода измерения средней длины теломер в нашей лаборатории использует точность, чувствительность и простота количественной ПЦР в реальном времени. Этот способ стал возможным для измерения длины теломер по разработке новых праймеров, которые избежать синтез димера праймера полученных продуктов, которые иначе были произведены в качествеtandard анализа из-за повторяющегося характера теломер. Для этого теста измерения длины теломер представлена ​​T / S коэффициент, теломер числа копий повтора к одной копии гена числом. Так как существует прямая пропорциональная зависимость между длиной теломер и количество меченых праймеров теломер связывания с ДНК во время начальной стадии ПЦР, T / S соотношение прямо пропорционально длине теломеров. T / S коэффициент измеряется путем сравнения разности Ct, дробное число циклов, при которой образец накопленных цветение пересекает порог, который несколько стандартных отклонений выше базового цветения, между образцами с теломер праймеры и праймеры SCG 19. Этот метод был подвергнут критике за ее косвенного измерения длины теломер, которые могут привести к неточным измерениям, например, в случае хромосомных дублирования или вариации числа копий 15. Кроме того, сравнение исследований часто диfficult, но стандартные олигомеров и созданы для измерения абсолютного длину теломер 20. Этот метод способствовал повышена за счет Cawthon, используя монохромный анализа кПЦР мультиплекса. В этом анализе ПЦР проводили при более низких температурах в течение первых нескольких циклов, чтобы избежать праймер-димеров связывания и теломер и контрольного гена были проанализированы в той же пробирке ПЦР дальнейшей избежать ошибки. Полученный в результате измерения длины теломер коррелирует с длиной теломер измеряется Саузерн-блоттинга из ПВР и имели более высокую точность 15, 19, 36. На данный момент Qrt-PCR является единственным удобным способом для тестирования больших размеров образца и требует лишь небольшого количества ДНК осуществить. Важной частью этого метода заключается в комплексных мер по борьбе качества, так что, когда это сделано должным образом, этот метод может дать ценную информацию о сравнительных длину теломер. Кроме того, этот метод был адаптирован для использования вне лейкоцитов для измерениядлина теломер в различных тканях 42. Кроме того, в целях более глубокого понимания биологии за длину теломер и взаимодействия между двумя противоположными эффектами (то есть укорочение теломер во время репликации и удлинения фермент теломераза), мы сопровождали длины теломер методом с дополнительным анализом, который измеряет активность теломеразы. Для этой цели мы использовали протокол амплификации теломерных Повтор, Анализ in vitro. Вкратце, лизируют сохранена, ферментативно активной клетки синтезировали теломерных повторов на подложку с использованием олигонуклеотидных теломеразы, и продукты были амплифицированы с помощью ПЦР в присутствии SYBR Green. Затем результаты были проанализированы путем сравнения образцов и контрольных значений Ct порога. Так как теломераза теплочувствительную фермента, дополнительные термообработке управления запуске рядом друг с образцом 21. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; При измерении длины теломеров может предоставить ценную информацию о возможной роли длину теломер в патофизиологии старения и болезней, длина теломер не статическое свойство и больше информации, необходимой для понимания функции теломер. Исследования Активность теломеразы может добавить информацию о механизмах регулирования теломер длины. Например, управления активацией теломеразы может поддерживать длину теломер и клеточную пролиферацию, но неконтролируемой активации теломеразы может привести к раку. Эти два недорогих и прямой методы в сочетании предоставили нам не только к более убедительные доказательства взаимосвязи между длиной теломер и клеточной стабильности, но и более глубокое представление о возможных механизмах укорочение теломер и восстановления. С помощью этих методов мы надеемся и далее выяснить реакцию клетки к старению и различные состояния клеточной пролиферации с конечной целью лучшего понимания центральной mechanisMS клеточной биологии.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Quantitative Telomerase Detection </td>
 <td>Allied Biotech </td>
 <td>MT3012 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Qiagen DNeasy Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>69506</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument</td>
 <td>Roche Diagnostics</td>
 <td>4707516</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

telomere length and telomerase activity; a yin and yang of cell senescence

Теломеры повторяющихся последовательностей ДНК на конце концов хромосом, которые разнообразны по длине и в организме человека может достигать в длину 15 000 пар оснований. Теломер служит биозащитные механизм хромосомы истощение в каждом делении клетки. В определенной длины, теломеры становятся слишком короткими, чтобы репликация, процесс, который может привести к хромосомной нестабильности или гибель клеток. Длина теломер регулируется двумя противоположными механизмами: истощение и удлинения. Истощение происходит в каждом делении клетки. В противоположность этому, удлинение частично модулированный с помощью фермента теломеразы, который добавляет повторяющихся последовательностей на концах хромосом. Таким образом, теломераза, возможно обратное механизма старения и омолаживает жизнеспособности клеток. Они играют ключевую роль в поддержании жизни клетки и используются для оценки клеточного старения. В этой рукописи мы опишем точные, короткие, сложные и дешевый метод оценки длины теломеров в различных тканяхс и видов. Этот метод использует два основных элемента, тандемных повторов теломер последовательности и чувствительность QRT-PCR для обнаружения дифференциального числа копий испытуемых образцов. Кроме того, мы опишем простой анализ для оценки активности теломеразы в качестве дополнительного теста для основы длину теломер.

Пример длину теломер QRT-PCR анализа показан на рисунке 1. В левой верхней части панели, образцы помечены красным и зеленым представлять расположение предметов протестированы на 96-луночный планшет. В правом верхнем углу панели, кривой усиления демонстрируется. Каждый предмет про...

Watch this Scientific Journal Video about Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence at JoVE.com

Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

Точные, короткие, сложные и дешевый способ описан, который оценивает длину теломер во многих тканях и видам использования Qrt-PCR. Кроме того, мы опишем простой анализ для оценки активности теломеразы в качестве дополнительного теста для основы длину теломер.

Длиной теломер и теломеразы, Инь и Ян клеточного старения

Telomeres  are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse  in length and in humans can reach a length of 15,000 base ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Biology

Unit 1

DNA Replication

SCIENTISTS IN ACTION

Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay

Трансмембранного домена олигомеризации склонность определяется Пробирной ToxR

The oversimplified view of protein transmembrane domains as merely anchors in phospholipid bilayers has long since been disproven.  In many cases ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

В пробирке восстановление активность Т. castaneum Теломераза

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Эффективное Вывод прав Сердечная Прекурсоры и кардиомиоциты из плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека с малыми Индукционная Молекула

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

Мониторинг убиквитин-протеасомной активности в живых клетках с помощью Degron (DGN)-дестабилизировали зеленого флуоресцентного белка (GFP)-Reporter на основе белков

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Измерения клеточных Хемотаксис с ECIS / Такси

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

В пробирке миграции клеток и Вторжение Анализы

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Сниженной гравитационные окружающей среды и комплектующие Демонстрации проточной цитометрии и Companion микрожидкостных Технология смешивания Прототип миниатюрных

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

Соотнося геноспецифических метилирования ДНК изменения с выражением и транскрипционной активности астроцитарных<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

Метод измерения активности ферментов Deubiquitinating в клеточных линиях и образцы тканей

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Применения с одним зондом: Масс-спектрометрия и цифровой обработки изображений Single Cell Анализ в условиях окружающей среды

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...