Name: telomere length and telomerase activity; a yin and yang of cell senescence
Uploaded: 2013-05-22T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence at JoVE.com

Ett. Telomerlängd protokoll 19 <ol><li> DNA-isolering </li></ol> De flesta DNA-isolering metoder får användas. Vår Lab föredrar Qiagen DNeasy Kit (# 69506) för blod källor. Beroende på källan av DNA, såsom buckala eller andra källor, kan en annan isolering metod användas. <ol start="2"><li> Primrar: </li></ol> Alla primers späds ut till en stamkoncentration av 100pmoles/μl i PCR-kvalitet vatten och lagrades vid -20 ° C fram till användning....

Telomerlängd ger en unik cellulär markör för att studera den stressade och åldrande cellen och erbjuder insikter i mekanismerna för åldrande. Sedan dess roll i åldrandet hade först föreslagits, har en mängd studier gjorts om telomerlängd till ålder, livslängd, åldersrelaterade sjukdomar, cancer, och stress. Under årtionden var guldmyntfoten av telomerlängd mätningar terminal restriktionsfragment analys med Southern hybridisering. Men nyligen en prisvärd, snabb och lätt att utföra metoden genom Cawth...

Telomererna upprepande DNA hexamer (TTAGGG) sekvenser som finns i ändarna av kromosomerna. I varje cell replikering, dessa kromosom ändarna förkortas. Om de blir för kort kan kromosomer genomgå telomer end fusioner, aberrant rekombinationsställen, och nedbrytning. Således tillräcklig telomerlängd underhåll spelar en viktig roll i kromosom stabilitet och cellskydd 38. Telomerlängd underhåll är också avgörande för gener som finns nära ändarna av kromosomer, eftersom DNA-replikation inte kan fortsätta till slutet av kromosomer 1-2. Följaktligen kan förebyggande av telomerförkortning förbättra cellernas stabilitet. Ett flertal studier har rapporterat att telomerlängd är korrelerad med en organisms livslängd och sjukt tillstånd, t.ex. vid cancer 3-4, diabetes 5 och hjärtkärlsjukdom 6,7. Dessutom har förkortade telomerer förknippats med överdriven stress ellerohälsosam livsstil 8, kanske genom att främja tidig cellernas åldrande och död 9. Å andra sidan har vissa studier funnit att det inte finns någon signifikant skillnad mellan telomerlängd och livslängd och åldersrelaterad sjukdom 39, 40, 41. En av cellens inneboende mekanismer för skydd mot telomerförkortning är genom att aktivera sin egen enzymet transkriptas telomeras omvänt (tert). Detta enzym och dess subenhet, telomeras RNA (TERC), en icke-kodande RNA, använd telomeren som en mall för att lägga till telomer upprepningar till kromosom ändar 10. Även telomerasaktivitet är frånvarande från flera typer av celler och andra mekanismer är involverade i telomerlängd underhåll, är ökad telomerasaktivitet korrelerade med ökad telomerlängd. Telomeras aktivering har etablerats som en av de mekanismer som gör att celler svarar på skada och stress och undvika för tidigt åldrande och död. Exempelvis längre telomeres visades i en population av Ashkenazi judar med exceptionell livslängd 11, har mutationer i TERC eller tert visats bidra till dödlig sjukdom 12, och epigenetisk reglering av telomeras har visat sig ha effekt på åldersrelaterade sjukdomar 13. Sedan dess upptäckt, har telomerlängd föreslagits som en biomarkör för hälsotillståndet i olika djurmodeller samt hos människor, men dessa tidiga studier var svåra att allmänt replikera eftersom metoden som användes var tråkiga, långa och dyra. Under 2002 och ytterligare stämda 2009 föreslog Cawthon och demonstrerade en ny, korrekt, snabb och enkel PCR-baserat protokoll för att bedöma telomerlängd och ytterligare undersöka dess roll i olika aspekter av cellbiologi, åldrande och sjukdom 19. Välja rätt metod telomere mätning för en studie är nödvändig. För närvarande finns det olika metoder som används för att mäta telomerlängd, alla med sin egenfördelar och nackdelar. Traditionellt är telomerlängd mäts med Southern blot-analys av fragment terminal begränsning (TRFs), vilket innebär: en. uppslutning av DNA med restriktionsenzym som inte skär i telomere upprepningar för att få TRFs, b.. Southern blöt av dessa TRFs görs genom bestämning av medelvärdet TRF längd med användning av en telomer sond 14, 37. Även om denna metod är mycket exakt med en liten variationskoefficient, är ett direkt mått, och kan vara fördelaktigt för mätning längdfördelning är TRF analys kostsamt, arbetskrävande och kräver minst tre ig DNA. Denna metod är också okänslig för korta telomerer och längd bestämning kan förväxlas med subtelomeric DNA, vilket kan detekteras av sonden på grund av (TTAGGG) n liknande sekvenser de innehåller 15, 42. En annan mycket noggrann metod för att mäta telomerlängd är singel Telomere Förlängning Längd Analysis (STELA), en single molekyl PCR-baserad metod som endast kräver en liten mängd DNA. I denna metod används primrar görs för att erkänna det G-rika överhäng i slutet av kromosomer och att binda till en unik subtelomeric sekvens på en kromosom, som förstärker telomeren av en specifik kromosom. Den erhållna amplifieringen visualiseras sedan genom Southern blöt. Denna metod har fördelen av att vara mycket noggrann och kan upptäcka korta utanförliggande telomerer 16. Tyvärr, eftersom inte alla kromosomer har G-rika ändarna och en användbar subtelomeric sekvens, kan telomerlängd endast mätas på specifika kromosomer, och dessa mätningar får inte representera längden på alla telomerer i cellen 15. En annan metod som har utövats är användningen av peptidnukleinsyra (PNA) prober för att detektera telomerlängd. Kvantitativ Florescence in situ hybridisering (Q-FISH) tillåter oss att visualisera telomererna under metafas, där staining av telomerer med en PNA-sonden i förhållande till deras storlek tillåter jämförelse av telomerer mellan specifika kromosomer. Även om denna metod kan också användas för celler i interfas, här den telomerlängd för distinkta kromosomer inte kan upptäckas, som inför en begränsning vid mätning av telomerlängd i åldrande eller sällan delande celler 17. Flow FISH använder istället flödescytometri och är för närvarande den mest känsliga metoden för att mäta telomerlängd i blodceller i klinisk miljö, men kräver högt kvalificerade tekniker 18. För närvarande tar standardmetoden för mätning av genomsnittlig telomerlängd i vårt labb fördel av precision, känslighet och enkel kvantitativ realtids-PCR. Denna metod blev möjligt för mätning av telomerlängd genom utveckling av nya primrar som undviker syntesen av primer-dimer-härledda produkter, som annars skulle ha producerats i somtandard analys på grund av den repeterande karaktären hos telomerer. För denna analys utförs mätningen av telomerlängd representeras av T / S-förhållandet, telomeren upprepa kopietalet till singel-kopia gen nummer. Eftersom det finns ett direkt proportionellt förhållande mellan telomerlängd och antalet märkta telomer primrar bindning till DNA under början stadier av PCR, är T / S-förhållandet direkt proportionell mot telomerlängd. T / S-förhållandet mäts genom att jämföra skillnaden i Ct, korsar fraktionerad cykelantalet vid vilken provet ackumulerade blomningstid en tröskel som är flera standardavvikelser över baslinjen blomningstid, mellan prover med telomere primers och SCG primers 19. Denna metod har kritiserats för dess indirekt mätning av telomerlängd, vilket kan leda till felaktiga mätningar, till exempel i fallet med kromosom dubbelarbete eller kopiera variationer nummer 15. Dessutom är jämförelsen mellan studier ofta difficult, men standard oligomerer har utvecklats för att mäta absolut telomerlängd 20. Denna metod har furthered förbättrats av Cawthon, med användning av en monokrom assay multiplex qPCR. Vid denna analys var PCR köras vid lägre temperaturer för de första få cykler för att undvika primerdimerer bindande och telomeren och kontroll-genen analyserades i samma PCR-rör för att ytterligare undvika fel. De resulterande telomerlängd mätningar korreleras starkt med telomerlängd mätt med Southern blot-analys av TRFs och hade högre noggrannhet 15, 19, 36. Just nu är QRT-PCR den enda bekväm metod för att testa stora provstorlekar och endast kräver en liten mängd DNA för att utföra. En viktig del av denna metod är omfattande åtgärder för kvalitetskontroll, så att när det är gjort på rätt sätt, kan denna metod ge värdefull jämförande information om telomerlängd. Dessutom hade denna metod är anpassad för användning utöver leukocyter för att mätatelomerlängd i en variation av olika vävnader 42. Dessutom, i syfte att ytterligare förstå biologin bakom telomerlängd underhåll och interaktioner mellan de två motsatta effekter (dvs. telomerförkortning vid replikering och töjning av telomeras enzym), tillsammans vi den telomerlängd metoden med en ytterligare analys som mäter telomerasaktivitet. För detta ändamål använde vi en telomerisk protokoll Repeat Förstärkning, en in vitro-analys. Kortfattat lyseras, konserverade, enzymatiskt aktiva celler syntetiserade telomeric upprepningar på en oligonukleotid substrat med telomeras, och produkterna förstärktes med PCR i närvaro av SYBR Green. Resultaten analyserades sedan genom att jämföra prov-och kontroll-Ct-tröskelvärden. Eftersom telomeras är ett värmekänsligt enzym, är en ytterligare värmebehandlas kontroll löpa parallellt varje prov 21. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Medan mäta telomerlängd kan ge värdefull insikt i den eventuella roll telomerlängd i patofysiologin av åldrande och sjukdom, är telomerlängd inte en statisk egenskap och mer information behövs för att förstå telomer funktion. Telomerasaktivitet studier kan lägga till information om telomere mekanismer längd reglering. Till exempel kan den styrda aktiveringen av telomeras upprätthålla telomerlängd och cellproliferation, men okontrollerad aktivering av telomeras kan leda till cancer. Dessa två billiga och rakt fram kombinerade metoder gav oss inte bara med starkare bevis mot ett samband mellan telomerlängd och cell stabilitet, men också ytterligare insikt i de eventuella mekanismer för telomerförkortning och återhämtning. Med dessa metoder hoppas vi att ytterligare belysa cellens svar på åldrande och olika stadier av celltillväxt med det yttersta målet för en bättre förståelse av centrala mechanisms av cellbiologi.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Quantitative Telomerase Detection </td>
 <td>Allied Biotech </td>
 <td>MT3012 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Qiagen DNeasy Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>69506</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument</td>
 <td>Roche Diagnostics</td>
 <td>4707516</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

telomere length and telomerase activity; a yin and yang of cell senescence

Telomererna upprepande DNA-sekvenser vid spetsen kromosomernas ändar som är olika i längd och i människor kan nå en längd av 15.000 baspar. Telomeren fungerar som en bioskyddande mekanism av kromosom avgång vid varje celldelning. Vid en viss längd, telomererna blir för kort för att möjliggöra replikering, en process som kan leda till kromosom instabilitet eller celldöd. Telomerelängden regleras av två motsatta mekanismer: attrition och förlängning. Slitage uppstår eftersom varje cell delar. I motsats härtill är töjning delvis moduleras av enzymet telomeras, som lägger repeterande sekvenser till ändarna av kromosomerna. På detta sätt kunde telomeras vända möjligen en åldrande mekanism och vitaliserar cellernas livskraft. Dessa är avgörande faktorer för att upprätthålla cellens liv och används för att bedöma cellulära åldrandet. I detta manuskript kommer vi att beskriva en exakt, kort, sofistikerad och billig metod för att bedöma telomerlängd i flera vävnaders och arter. Denna metod tar fördel av två viktiga delar, tandemupprepningsregionen av telomer sekvensen och känsligheten hos QRT-PCR för att detektera antalet differentiella kopia av prover. Dessutom kommer vi att beskriva en enkel analys för att bedöma telomerasaktiviteten som ett komplement ryggrad test för telomerlängd.

Ett exempel på en telomerlängd QRT-PCR-analysen visas i figur 1. På den övre vänstra panelen, prover märkta i rött och grönt representerar placeringen av de testade ämnena på 96-brunnar. På den övre högra panelen, är amplifieringskurva påvisas. Varje ämne testas av två analyser (Telomere och enkelkopiegen), vilket görs i triplikat. På grund av olika DNA-kopia siffror som produceras i de två analyser av utvalda personer, når antalet cykler tills blomningstid upptäckt dess exponentie...

Watch this Scientific Journal Video about Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence at JoVE.com

Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

En noggrann, kort, sofistikerad och billig metod beskrivs som bedömer telomerlängd i flera vävnader och arter med QRT-PCR. Dessutom kommer vi att beskriva en enkel analys för att bedöma telomerasaktiviteten som ett komplement ryggrad test för telomerlängd.

Telomerlängd och telomerasaktivitet, A Yin och Yang av cellåldrande

Telomeres  are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse  in length and in humans can reach a length of 15,000 base ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Biology

Unit 1

DNA Replication

SCIENTISTS IN ACTION

Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay

Transmembrana Domain oligomerisering Benägenhet bestäms av ToxR analys

The oversimplified view of protein transmembrane domains as merely anchors in phospholipid bilayers has long since been disproven.  In many cases ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Beredning av Active T. castaneum Telomeras

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Derivering av mänskliga Hjärtat prekursorer och Cardiomyocytes från Pluripotenta mänskliga embryonala stamcellslinjer med liten molekyl Induktion

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

Övervakning av ubiquitin-proteasom aktivitet i levande celler Använda en Degron (DGN)-destabiliseras grönt fluorescerande protein (GFP)-baserad Reporter protein

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Mätning av Cellular Kemotaxis med ECIS / Taxi

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration och Invasion Analyser

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Minskad gravitations Miljö Hårdvara Demonstrationer av en prototyp Miniaturized flödescytometer och Companion mikroflödes Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

Korrelera Genspecifika DNA-metylering Förändringar med uttryck och transkriptionsaktiviteten för astrocytisk<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

Förfarande för att mäta aktiviteten hos Deubiquitinating Enzymer i cellinjer och vävnadsprover

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Tillämpningar av Single-sonden: masspektrometri Imaging och Single cellanalys under normala förhållanden

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...