Name: telomere length and telomerase activity; a yin and yang of cell senescence
Uploaded: 2013-05-22T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence at JoVE.com

1. Telomer uzunluğu Protokol 19 <ol><li> DNA izolasyonu </li></ol> En DNA izolasyon yöntemleri kullanılabilir. Bizim Lab kan kaynakları için Qiagen DNeasy Kiti (# 69506) tercih ediyor. Örneğin bukkal ya da diğer kaynaklardan gelen DNA, bir kaynağına bağlı olarak, farklı bir izolasyon yöntemi de kullanılabilir. <ol start="2"><li> Astarlar: </li></ol> Tüm primerler PCR sınıf suda 100pmoles/μl &#39;lik bir stok konsantrasyonu seyreltildi ve...

Telomer uzunluğu stresli ve yaşlanma hücre incelemek için eşsiz bir hücresel işaretleyici sağlar ve yaşlanma mekanizmaları irdeliyoruz. Yaşlanma rolü ilk önerilmiştir olmadığından, çalışmalar çok sayıda yaşı telomer uzunluğu ile yapılmıştır, uzun ömürlü, yaş ile ilgili hastalık, kanser ve stres. On yıllardır, telomer uzunluğu ölçümleri altın standart Güney melezleme kullanarak terminal kısıtlama parçası analizi oldu. Ancak, son zamanlarda Cawthon tarafından, ekonomik, hızl...

Telomer kromozomların uçlarında bulunan DNA hexamer (TTAGGG) dizileri tekrarlıyor. Her hücre çoğaltma, bu kromozom uçları kısalır. Onlar çok kısa kalırsanız, kromozomların telomer sonunda füzyon, anormal rekombinasyon ve bozulma tabi olabilir. Bu nedenle yeterli telomer uzunluğu bakım kromozom istikrar ve hücre koruma 38 önemli bir rol oynar. Telomer uzunluğu bakım da kromozom uçları yanında bulundu genler için çok önemlidir, çünkü DNA replikasyonu kromozom 1-2 sonuna kadar devam edemez. Sonuç olarak, telomer kısalması önlenmesi hücre istikrarı artırabilir. Çeşitli çalışmalar telomer uzunluğu, 3-4, diyabet 5 ve kalp-damar hastalıkları 6,7 kanser gibi bir organizmanın uzun ömür ve hastalıklı devlet ile ilişkili olduğunu bildirmişlerdir. Ayrıca, kısaltılmış telomer aşırı stres ya da bir ile ilişkilendirilmiştirbelki erken hücre yaşlanma ve ölüm 9 teşvik ederek sağlıksız yaşam tarzı 8,. Öte yandan, bazı çalışmalarda hastalık 39, 40, 41 ilgili telomer uzunluğu ve uzun ömür ve yaş arasında anlamlı bir fark olduğunu bulduk. Telomer kısalması korunma hücrenin doğal mekanizmalardan biri kendi enzim telomeraz ters transkriptaz (TERT) aktive gereğidir. Bu enzim ve alt birimi, telomeraz RNA (TERC), bir kodlayıcı olmayan RNA, 10 sona erer kromozom telomer tekrar eklemek için bir şablon olarak telomer kullanın. Telomeraz aktivitesi hücreleri ve diğer mekanizmalar çeşitli telomer uzunluğu bakım katılan eksik olmasına rağmen, artan telomeraz aktivitesi artmış telomer uzunluğu ile ilişkilidir. Telomeraz aktivasyonu hücre hasarına cevap ve stres ve erken yaşlanma ve ölüm önlemek hangi mekanizmalardan biri olarak kurulmuştur. Örneğin, daha uzun telomeres olağanüstü ömrü 11 ile Aşkenazi Yahudilerin bir popülasyonda gösterildi, TERC veya TERT mutasyonlar yaşa bağlı hastalık 13 üzerinde bir etkiye sahip olduğu gösterilmiştir ölümcül hastalığı 12 ve telomeraz epigenetik düzenleme katkıda gösterilmiştir. Yılında keşfedilmesinden bu yana, telomer uzunluğu çeşitli hayvan modellerinde hem de insanlarda sağlık durumu için bir belirteç olarak önerdi, ancak kullanılan yöntem, sıkıcı uzun ve pahalı olduğu için bu ilk çalışmalarda yaygın olarak çoğaltmak için zordu edilmiştir. 2002 daha 2009 yılında ayarlanmış olarak, Cawthon önerilen ve telomer uzunluğu değerlendirmek ve daha fazla yaşlanma ve hastalık 19, hücre biyolojisi çeşitli yönleri rolünü araştırmak için yeni, doğru, hızlı ve basit bir PCR tabanlı protokol gösterdi. Bir çalışma için doğru telomer ölçüm metodu seçilmesi esastır. Şu anda, telomer uzunluğunu ölçmek için kullanılan çeşitli yöntemler kendi her vardıravantaj ve dezavantajları. A: Geleneksel olarak, telomer uzunluğu içerir terminal sınırlama parçaları Southern Blot analizi (TRFs) kullanılarak ölçülür. b TRFs elde etmek için tekrar telomer kesilmiş olmayan kısıtlama enzimleri ile DNA sindirici. Bu TRFs Southern Blot bir telomerik prob 14, 37 kullanılarak ortalama TRF uzunluğunu belirleyerek yapılır. Bu yöntem, bir varyasyon katsayısı ile son derece küçük bir doğru olmasına rağmen, doğrudan bir ölçüsüdür ve uzunluk dağılımı ölçmek için avantajlı olabilir, TRF analizi, emek yoğun maliyetlidir ve DNA bölgesinin en az 3 mg gerektirir. Bu yöntem prob tarafından nedeniyle (TTAGGG) n onlar, 42 15 içeren dizileri gibi tespit edilebilir subtelomerik DNA, karmakarışık hale olabilir kısa telomer ve uzunluk tayin duyarsız. Telomer uzunluğu ölçüm başka bir derece doğru bir yöntem Tek Telomer Uzama Uzunluk Analizi (STELA), bir singl olduğusadece DNA küçük bir miktar gerektirir E molekülü PCR tabanlı bir yöntemdir. Bu yöntemde, primerler kromozom sonunda G-zengin çıkıntı tanımak için ve belirli bir kromozom telomer güçlendirir bir kromozom üzerinde eşsiz bir subtelomerik sekansına bağlanmak için yapılır. Elde edilen amplifikasyon sonra Southern Blot tarafından görüntülenmiştir. Bu yöntem son derece doğru olma avantajına sahiptir ve kısa aykırı telomerlerin 16 tespit edebiliyor. Tüm kromozomlar G-zengin uçları ve kullanılabilir bir subtelomerik dizisi yazık ki, telomer uzunluğu sadece belirli kromozom üzerinde ölçülebilir ve bu ölçümlerin hücre 15 tüm telomer uzunluğu temsil olmayabilir. Uygulanmakta olan diğer bir yöntem telomer uzunluğu tespit etmek için, peptit nükleik asit (PNA) probların kullanılmasıdır. In situ Hibridizasyon Kantitatif floresans (Q-FISH) bize st metafaz sırasında telomerlerin görüntülemenizi sağlarbüyüklüklerine orantılı olarak bir PNA prob ile telomerlerin Aining belirli kromozom arasındaki telomer karşılaştırılması izin verir. Bu yöntem aynı zamanda interfaz hücreleri için de kullanılabilir, ancak burada farklı bir kromozom için telomer uzunluğu 17 yaşlı veya seyrek bölünen hücreleri telomer uzunluğu ölçülürken bir sınırlama getirmektedir ki, tespit edilemez. Akış BALIK yerine akım sitometri kullanır ve şu anda klinik ortamda kan hücrelerinin telomer uzunluğu ölçmek için en hassas yöntemdir, ancak çok yetenekli teknisyenler 18 gerektirir. Şu anda, bizim laboratuvarda ortalama telomer uzunluğu ölçmek için standart bir yöntem hassas, duyarlılık yararlanır ve kantitatif gerçek zamanlı PCR kolaylığı. Bu yöntem, aksi olarak üretilen olurdu primer-dimer-türevi ürünlerin sentezini önlemek yeni primerler gelişimi ile telomer uzunluğu ölçme mümkün oldutelomerlerin tekrar doğası gereği tandard testi. Bu tahlil için, telomer uzunluğunun ölçülmesi tek kopyalı gen sayısı için T / S oranı, telomer tekrar kopya sayısı ile temsil edilir. Telomer uzunluğu ve PCR başlangıç ​​aşamalarında esnasında DNA bağlama telomer etiketli primerlerin sayısı arasında doğru orantılı bir ilişki olduğu için, T / S oranı telomer uzunluğu ile doğrudan orantılıdır. T / S oranı Ct fark karşılaştırılarak ölçülür, örnek floresans birikmiş hangi fraksiyonel döngü sayısı telomer astar ile örnekleri ve astar 19 SCG arasında, taban floresans yukarıda birkaç standart sapma bir eşiği geçer. Bu yöntem, kromozom mükerrer veya kopya sayısı varyasyonları 15 durumunda, yanlış ölçümlere yol açabilir telomer uzunluğu dolaylı ölçümü, örneğin için eleştirilmiştir. Ayrıca, çalışmalar arasında karşılaştırma genellikle di olanfficult, ancak standart oligomerler mutlak telomer uzunluğu 20 ölçmek için geliştirilmiştir. Bu yöntem, tek renkli çok katlı qPCR testi kullanılarak, Cawthon tarafından üzerine geliştirilmiş daha da ileriye edildi. Bu deneyde, PCR primer-dimer bağlanma önlemek için ilk birkaç devir için daha düşük sıcaklıklarda gerçekleştirilir ve telomer ve kontrol geni daha fazla hata önlemek için, aynı PCR tüpü içinde analiz edildi. Ortaya çıkan telomer uzunluğu ölçümleri güçlü TRFs Southern blot analizi ile ölçülen telomer uzunluğu ile ilişkilidir ve yüksek doğruluk 15, 19, 36 oldu. Şu anda, QRT-PCR büyük çaplı test etmek için kullanılabilen tek uygun yöntem olup tek yürütmek için DNA küçük bir miktar gerektirir. Bu yöntemin çok önemli bir bölümü, bu doğru bitince, bu yöntem telomer uzunluğu hakkında değerli karşılaştırmalı bilgi sağlayabilir, böylece kapsamlı kalite kontrol önlemleri olduğunu. Buna ek olarak, bu yöntem ölçmek için lökositlerin dışında kullanım için adapte edilmişfarklı çok çeşitli dokulardan 42 telomer uzunluğu. Ayrıca, daha da telomer boyu bakım ve iki karşıt etkileri (telomeraz enzimi tarafından çoğaltma ve uzama sırasında yani telomer kısalması) arasındaki etkileşimleri arkasındaki biyoloji anlamak için, biz telomeraz aktivitesini ölçer ek yöntemi ile telomer uzunluğu yöntemi eşlik etti. Bu amaçla, bir Telomer Tekrar amplifıkasyon protokolü, bir in vitro deney kullanılabilir. Kısaca, lize, konserve, enzimatik olarak aktif hücrelerin telomeraz kullanılarak bir oligonükleotid alt tabaka üzerine telomerik tekrar sentezlenir ve ürünlerin SYBR Green mevcudiyetinde PCR ile amplifiye edildi. Sonuçlar daha sonra örnek karşılaştırma ve kontrol Ct eşik değerleri ile analiz edildi. Telomeraz bir ısıya duyarlı enzim olduğundan, ek bir ısı kontrol tedavi her bir örnek 21 ile birlikte çalıştırılır. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; telomer uzunluğu ölçme yaşlanma ve hastalığın patofizyolojisinde telomer uzunluğu olası rolüne değerli bilgiler sağlayabilir iken, telomer uzunluğu bir statik özellik ve daha fazla bilgi değildir telomer fonksiyonu anlamak için gereklidir. Telomeraz aktivite çalışmaları telomer uzunluğu düzenleme mekanizmaları hakkında bilgiler ekleyebilirsiniz. Örneğin, telomeraz kontrollü aktivasyonu telomer uzunluğu ve hücre çoğalmasını sürdürmek olabilir, ancak telomeraz kontrol dışı bir etkinleşme kansere neden olabilir. Birlikte bu iki ucuz ve yalındır yöntemleri telomer uzunluğu ve hücre istikrar arasında bir ilişki doğru daha güçlü kanıtlar değil, aynı zamanda telomer kısalması ve kurtarma olası mekanizmaları içine daha fazla anlayış ile sadece sağladı. Bu yöntemler ile, daha da merkezi mechanis daha iyi anlaşılması nihai hedefi ile yaşlanma ve hücre çoğalması çeşitli devletlere hücrenin cevabı aydınlatmak için umuthücre biyolojisi ms.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Quantitative Telomerase Detection </td>
 <td>Allied Biotech </td>
 <td>MT3012 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Qiagen DNeasy Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>69506</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument</td>
 <td>Roche Diagnostics</td>
 <td>4707516</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

telomere length and telomerase activity; a yin and yang of cell senescence

Telomer ucunda DNA dizileri tekrarlıyor uzunluğunda ve insanlarda çeşitlidir kromozom 15.000 baz çifti uzunluğunda ulaşabilirsiniz biter. Telomer her hücre bölünmesi de kromozom yıpratma Bio koruyucu mekanizması olarak hizmet vermektedir. Belirli bir süre de, telomerlerin çoğaltma, kromozom istikrarsızlık ya da hücre ölümüne yol açabilir bir süreç sağlamak için çok kısa olur. Yıpratma ve uzama: telomer uzunluğu iki karşıt mekanizmalarla düzenlenir. Her hücrenin bölünmesinden olarak yıpratma oluşur. Buna karşılık, uzama kromozomların uçlarına tekrar dizileri ekler enzim telomeraz, kısmen modüle edilir. Bu şekilde, telomeraz muhtemelen bir yaşlanma mekanizması ters ve hücre canlılığı gençleştirir olabilir. Bu hücre yaşam sürdürmek çok önemli unsurlardır ve hücresel yaşlanma değerlendirmek için kullanılır. Bu yazıda biz birden fazla dokuda telomer uzunluğu değerlendirmek için doğru, kısa, gelişmiş ve ucuz yöntem anlatacağıms ve tür. Bu yöntem, telomer dizisinin tandem tekrar ve test örneklerinin diferansiyel kopya sayıları tespit etmek için Mah-PCR duyarlılığı, iki temel unsuru yararlanır. Buna ek olarak, telomer uzunluğu için tamamlayıcı bir omurga test olarak telomeraz aktivitesini değerlendirmek için basit bir test tarif edecektir.

Telomer uzunluğu QRT-PCR bir örneği Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Sol üst paneli üzerinde, kırmızı ve yeşil İşaretlenmiş örnekler 96 oyuklu plaka üzerine test deneklerin yeri temsil eder. Sağ üst panelinde, kuvvetlenme eğrisinin gösterilmiştir. Her konuda triplicates yapılır iki testleri (Telomer ve Tek Kopya Gen), tarafından test edilir. Seçilen bireylerin iki tahlil içinde üretilen farklı DNA kopya sayısı nedeniyle, floresans algılama kadar çevrim sayısı ve logaritm...

Watch this Scientific Journal Video about Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence at JoVE.com

Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

Doğru, kısa sofistike ve ucuz bir yöntem birden fazla doku ve Mah-PCR kullanarak türlerde telomer uzunluğu değerlendirir olduğu açıklanmıştır. Buna ek olarak, telomer uzunluğu için tamamlayıcı bir omurga test olarak telomeraz aktivitesini değerlendirmek için basit bir test tarif edecektir.

Telomer uzunluğu ve Telomeraz Aktivitesi, Hücre Yaşlılık bir Yin ve Yang

Telomeres  are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse  in length and in humans can reach a length of 15,000 base ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Biology

Unit 1

DNA Replication

SCIENTISTS IN ACTION

Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay

ToxR Assay tarafından belirlenen Transmembran Domain Oligomerization Eğilimi

The oversimplified view of protein transmembrane domains as merely anchors in phospholipid bilayers has long since been disproven.  In many cases ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

Yaşayan Hücreler ubikitin-proteozom Faaliyet Monitoring Degron (DGN)-destabilize Yeşil floresan proteini (GFP) tabanlı Muhabir Protein Kullanımı

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

ECIS / Taksiler ile Hücresel Kemotaksis Ölçümü

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Vitro Hücre Göç ve Invasion Tahliller

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Prototip Minyatür Akış Sitometresi ve Companion mikroakışkan Karıştırma Teknoloji İndirimli-gravite Çevre Donanım Gösterileri

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

Gen spesifik ifadesi ile DNA Methylation değişiklikler astrositik transkripsiyonel Aktivite ilişkilendirilmesi<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

Hücre Kuşakları ve Doku Örneklerinde Deubiquitinating Enzim aktivitesinin ölçülmesi için bir yöntem

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Tek prob Uygulamalar: Ortam Koşullarında Kütle Spektrometre Görüntüleme ve Tek Hücre Analizi

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...