Name: a method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular camp determination
Uploaded: 2014-06-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination at JoVE.com

我々は、この作品に記載されているプロトコルに関する専門技術的な支援のためにレニー·L. PaskerとHarpreet K. BRARに感謝したいと思います。さらに、我々は、私たちに時間を与え、その研究室のメンバーのサポートに加え、ウィスコンシン大学マディソン校のデューク大学とアラン·D·AttieでクリストファーB.ニューガードの指導を認識し最適化するために必要な支援を希望プロトコールを記載した。特に、我々は生産的な議論やアドバイスをAttie研究室でのニューガード研究所とメアリーRabagliaにおけるハンスHohmeier、Danhong呂、ヘレナウィンフィールドに感謝します。この作品は、NIHの助成金DK080845と若年性糖尿病594によってサポートされていました （MEK）の研究財団助成17-2011-608

すべての動物実験は、関連するすべてのガイドライン、規制、規制当局を遵守して実施された。実証されているプロトコルは、ウィスコンシン大学マディソン校の施設内動物管理使用委員会（IACUC）の指導と承認の下で行われた。 ソリューションの1。準備<ol><li>このプロトコルでの安楽死の方法は、（代替案の検討のため、説明を参照）アベルチン麻酔下で放血です。?...

<ol>
	<li>Cryer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoglycaemia:+the+limiting+factor+in+the+glycaemic+management+of+Type+I+and+Type+II+diabetes.">Hypoglycaemia: the limiting factor in the glycaemic management of Type I and Type II diabetes.</a> Diabetologia. 45, 937-948 (2002).</li><li>Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition,+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+and+its+complications.+Part+1:+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+provisional+report+of+a+WHO+consultation.">Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation.</a> Diabet Med. 15, 539-553 (1998).</li><li>Muoio, D. 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T., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+can+cause+sustained+hyperglycemia+in+C57/BL6J+mice.">Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice.</a> Vis Neurosci. 22, 615-618 (2005).</li><li>Vaupel, D. B., McCoun, D., Cone, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phencyclidine+analogs+and+precursors:+rotarod+and+lethal+dose+studies+in+the+mouse.">Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse.</a> J Pharmacol Exp Ther. 230, 20-27 (1984).</li><li>Davis, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxM1+is+up-regulated+by+obesity+and+stimulates+beta-cell+proliferation.">FoxM1 is up-regulated by obesity and stimulates beta-cell proliferation.</a> Mol Endocrinol. 24, 1822-1834 (2010).</li><li>Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. 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糖尿病の有病率は世界人口の7.7％に影響を与えると予測して、新たな研究技術の必要性を理解し、糖尿病の18の治療の両方に不可欠である。現在の膵島単離は、in vitro実験のために使用される十分に確立されたプロトコルであり、若干の修正11,14,16と、以前に提示されてきた。インスリン分泌が孤立した島のための共通のダウンストリームアプリケーションであるが、こ...

正常血糖の厳格な維持管理は、すべて制御されていない1型および2型糖尿病1の病態の特徴である、このような神経障害、腎症、および網膜症など合併症を予防することが不可欠です。 1型および2型糖尿病の両方において低減β-細胞機能及び質量は、血中グルコース濃度を摂動2。一方、インスリン産生β細胞、2型糖尿病におけるシグナル伝達が損なわβ細胞のインスリン分泌と末梢インスリンの壊滅的な損失から免疫介在1型糖尿病の結果は一緒に高血糖を促進し、脂質異常症、そして最終的には、その結果、肝臓のグルコース産生を増加個々のβ細胞3からβ細胞量およびインスリン分泌能力の喪失の両方。 1型および2型糖尿病の進行の根底にあるβ細胞のメカニズムを理解することは、うまくいけば、これらの病気を予防し、治療する新しい治療法を生じさせる。 インビトロ TI 中例えば、INS-1およびMIN6としてssue培養モデルは、β-不死化細胞株、特定のβ-細胞機能を理解するための有用なツールであることができる。しかしながら、膵島内の異なる細胞型間の相互作用は、それ自体、β-細胞機能を調節し得る。例えば、グルカゴンのパラクリン影響は（α-細胞から放出）およびインスリン分泌を増加させ、減少におけるソマトスタチン（δ-細胞から放出された）、それぞれ、内分泌応答し4のセル、セルの近接の重要性を示している。また、β-細胞間のギャップ結合は、インスリン5のリリースを増強する。ストライドが良い（ 例えば 、INS-1由来の13分の832及び3分の832細胞株）をグルコースに単離された膵島の生理学的応答をレプリケートインスリノーマ線を生成する際になされているが、さらに、それらのグルコース応答性は依然として正常ラットとは異なる小島6,7。さらに、これらのクローンインスリノーマ細胞系の応答グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）アゴニストは、互いに、ならびに正常膵島6から大幅に異なることができる。従って、不死化細胞株は、エージェントにcAMP産生に与える影響を分析するための最良のモデルを表していない場合があります。 インスリノーマ由来細胞株とは対照的に、全動物モ​​デルにおいてのみβ-細胞機能を研究する合併症の独自のセットを提供する。内分泌組織での作業中の最大の課題の1つは、リリースされホルモンの正確な濃度を測定している。具体的には、肝臓は、インスリンの代謝の主要な役割を果たし、膵臓血流は、肝臓へ直接進む。従って、血漿インスリン測定を正確膵臓自体またはインスリン分泌速度8上の異なる治療の影響から分泌されるインスリンの量を描くなくてもよい。さらに、グルカゴンの腎代謝は膵島α細胞からのグルカゴンの出力の信頼性を制限する可能性がある9。したがって、in vitroの実験のために、一次マウス膵島を単離する膵島は、生体内で行われた測定を補完するために特定の刺激に応答しているかをより正確に把握することができます。 マウス膵島を分離するために、本 ​​プロトコルは、（成功を高めるために役立つことが若干の修正を加えた）グループの数10,11で使用される十分に確立されたプロトコルです。また、cAMP産生の決定は、β細胞のインクレチン応答性の直接の読み出しが可能になります。 cAMPの測定、タンパク質含有量およびインスリン分泌に関連しても、β細胞機能に欠陥のcAMP 10に対して近位または遠位にあるかどうかを決定するのに役立つ、同一のcAMPサンプル調製から定量することができる。このプロトコルの最後のcAMP量およびインスリン分泌アプリケーションは、他の中で、医薬品や栄養成分の影響を理解するための非常に強力なツールになりますS、cAMPおよびインスリン分泌に対する。グルコースのみからの刺激に加えて、他の化合物は、cAMPおよびインスリン分泌10,11の変化を測定するために使用することができる。 インスリンは、我々は孤立した島、グルカゴンおよびソマトスタチンのような他のホルモン、だけでなく、サイトカイン、エイコサノイド、および環状アデノシン一リン酸から検定する主要なホルモンであるが、最終的には、過渡刺激アッセイにより、またはの定量化のいずれかによって測定することができる培養液12中のそれらのレベル。他の多くの下流のアプリケーションが、膵島移植、PCRまたはマイクロアレイ分析、定量的リアルタイムためのRNAの単離、タンパク質として、追求され得るように、最終的に、記載コラゲナーゼ単離方法では、本稿の範囲外の膵島単離膵島の保存を可能にするもののウェスタンブロッティング、膵島埋め込み、免疫蛍光イメージング、膵島細胞REPLIの尺度としての[3 H] - チミジン取り込みの分離以前のJoveの記事13〜16に記載されており、そのうちのいくつかの陽イオン、。全体的に、プロトコルに記載膵島単離方法を次の治療法を開発し、β細胞の機能を高めることを目的とした薬剤の発見を促進するための重要かつ有用な情報を研究者に提供することができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="502">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:235px;">Collagenase: Collagenase from Clostridium histolyticum suitable for isolating active islets</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">C7657</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Ficoll 400</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9378</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Hanks Balanced Salt Solution 10X</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen (Gibco)</td>
			<td>14065-056</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Hepes</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">RPMI 1640 (powder)</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen (Gibco)</td>
			<td style="width:136px;">31800-022</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Albumin from Bovine Serum (BSA)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7888</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">3/0 Silk Suture Thread</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td>18020-30</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">0.8 mm Forceps&#160;&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools&#160;&#160;</td>
			<td style="width:136px;">11050-10</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Curved Scissors</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools&#160;&#160;</td>
			<td style="width:136px;">14061-10</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:235px;">Vannas-T&#252;bingen Spring Scissors - Straight/Sharp/8.5 cm/5 mm Cutting Edge</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">15003-08</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Dissecting Scissors</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools&#160;&#160;</td>
			<td style="width:136px;">14002-14</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">5ml BD Luer-Lok Syringe</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td style="width:136px;">309646</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">1ml BD syringe</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td style="width:136px;">309628</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">30 G BD Needle 1/2&#34; Length</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td style="width:136px;">305106</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">27 G BD Needle 1/2&#34; Length</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td style="width:136px;">305109</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Sharpening Stone</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">29008-01</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">2-2-2 tribromoethanol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">T48402-25G</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">2-methyl-2-butanol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>240486-100mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:235px;">Monopotassium Phosphate (KH2PO4)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">P0662</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:235px;">Sodium Bicarbonate (NaCHO3)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">S6014</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:235px;">CaCl2 *2H2O</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">C3881</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:235px;">MgSO4 *7H2O</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">M9397</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen (Gibco)</td>
			<td style="width:136px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:235px;">Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">SH30088.03HI</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">5879-100MG</td>
		</tr>
	</tbody>
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a method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular camp determination

制御されていない血糖は糖尿病の特徴であると神経障害、腎症、網膜症などの合併症とを促進する。糖尿病、免疫介在性の両方のタイプ1と肥満-結合型2の有病率の増加とともに、糖尿病の病態生理と治療メカニズムの輪郭を描くことを目的とした研究は極めて重要である。膵臓のランゲルハンス島のβ細胞は、適当に上昇した血中グルコース濃度に応答してインスリンを分泌する責任がある。グルコースなどの栄養素に加えて、β-細胞は、（特定のホルモンによって刺激され、食事に応答して腸から分泌されるインクレチンと称される、細胞内環状アデノシン一リン酸の産生を増加させるβ-細胞受容体に作用しているcAMP）の。 2型糖尿病の病態生理に寄与することがよく理解され、また、ますますw iをリンクされているβ-細胞機能、質量、およびインクレチン応答性の低下第1型糖尿病。現在のマウスの膵島分離とcAMP測定プロトコルは、疾患の進行および治療的介入、細胞内cAMP産生の調節を介して作用する受容体をインクレチン受容体によって媒介されるかまたは関連していることを特にを促進メカニズムを描写するのに役立つツールとなります。唯一のcAMP測定は説明するが、説明した膵島単離プロトコールはまた、グルコースを含む他の多くの下 ​​流の適用を可能にするクリーンな製剤を作成し、インスリン分泌を刺激し、[3 H] -チミジン取り込み、タンパク質存在量及びmRNA発現。

単離の間、高膵島収量を確保するために、プロトコルに概要の外科技術は、密接に従うべきである。ここで紹介するテクニックは、各研究室に合わせて調整することになるが、成功した分離につながるいくつかの重要なステップがあります。総胆管は簡単にアクセスできるようにするためには、臓器をマウスの右側（ 図1）に変位することをお勧めします。さらに、この拡張を制...

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A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

ランゲルハンス単離したマウスの膵島を用いたin vitroβ細胞機能をアッセイすることは、糖尿病の病態と治療薬の研究に重要な要素である。多くの下流のアプリケーションが利用可能であるが、このプロトコルは、具体的にはβ細胞機能を決定する本質的なパラメータとして、細胞内サイクリックアデノシン一リン酸（cAMP）の測定を記載する。

マウス膵島の単離と細胞内cAMP測定法

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Research

JoVE Journal

Biology

Murine Pancreatic Islet Isolation

マウス膵島単離

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

人間の膵島単離：パートI：膵組織の消化とコレクション

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

人間の膵島単離：パートII：ヒト膵島の精製と​​文化

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

膵島質量、サイズ分布とアーキテクチャのコンピュータ支援大規模可視化と定量化

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

コラゲナーゼと中性プロテアーゼの精製の組合せを用いて単離ランゲルハンスマウスの膵島

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

マウスプライマリ膵臓腺房細胞の単離と培養

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Near Infrared (NIr) Light Increases Expression of a Marker of Mitochondrial Function in the Mouse Vestibular Sensory Epithelium

Near Infrared NIr Light Increases Expression of a Marker of Mitochondrial Function in the Mouse Vestibular Sensory Epithelium

近赤外（NIR）の光は、マウス前庭感覚上皮におけるミトコンドリア機能のマーカーの発現を増加させる

Strategies for attenuating decline in balance function with increasing age are predominantly focused on physical therapies including balance tasks and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

新生児および成人マウス皮膚由来の初代マウスケラチノサイトの単離および培養

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

マウスからの膵島分離のための簡単な高効率プロトコル

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse

マウスで大網に膵島移植法

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet ...