Name: a method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular camp determination
Uploaded: 2014-06-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer a Renee L. Pasker e Harpreet K. Brar para assistência técnica especializada sobre os protocolos descritos neste trabalho. Além disso, gostaríamos de reconhecer a orientação de Christopher B. Newgard na Duke University e Alan D. Attie na Universidade de Wisconsin-Madison, juntamente com o apoio de seus membros de laboratório, o que nos permitiu a tempo e apoio necessários para otimizar o protocolos descritos. Em particular, agradecemos Hans Hohmeier, Danhong Lu, e Helena Winfield no Laboratório Newgard e Maria Rabaglia no Laboratório Attie para discussões produtivas e conselhos. Este trabalho foi financiado pelo NIH DK080845 concessão e diabetes juvenil 594 Fundação de Pesquisa de concessão 17-2011-608 (a MEK)

Todos os experimentos com animais foram executados em conformidade com todas as diretrizes, regulamentos e agências reguladoras. O protocolo que está sendo demonstrada foi realizada sob a orientação e aprovação do Animal Care e Use Comitê Institucional (IACUC), da Universidade de Wisconsin-Madison. 1. Preparação de Soluções <ol><li> O método de eutanásia neste protocolo é sangria sob anestesia Avertin (para uma revisão de alternativas, ver Discussão). Para fazer Avertin, ad...

<ol>
	<li>Cryer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoglycaemia:+the+limiting+factor+in+the+glycaemic+management+of+Type+I+and+Type+II+diabetes.">Hypoglycaemia: the limiting factor in the glycaemic management of Type I and Type II diabetes.</a> Diabetologia. 45, 937-948 (2002).</li><li>Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition,+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+and+its+complications.+Part+1:+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+provisional+report+of+a+WHO+consultation.">Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation.</a> Diabet Med. 15, 539-553 (1998).</li><li>Muoio, D. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxM1+is+up-regulated+by+obesity+and+stimulates+beta-cell+proliferation.">FoxM1 is up-regulated by obesity and stimulates beta-cell proliferation.</a> Mol Endocrinol. 24, 1822-1834 (2010).</li><li>Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. 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Com a prevalência de diabetes projetados para afetar 7,7% da população do mundo, a exigência de novas técnicas de pesquisa é fundamental para entender e tratar a diabetes 18. O presente isolamento de ilhotas é um protocolo bem estabelecido utilizado para experimentação in vitro e tem sido apresentado anteriormente, com ligeiras modificações 11,14,16. Embora a secreção de insulina é uma aplicação comum para a jusante ilhotas isoladas, com foco em componentes a montante, tais...

A manutenção rigorosa de euglicemia é imperativo para evitar morbidades, tais como neuropatia, nefropatia e retinopatia, que são todas as características da patologia da descontrolada tipo 1 e 2 diabetes 1. Função das células-β e de massa em ambos tipo 1 e diabetes 2 perturbar as concentrações de glicose no sangue 2. Considerando tipo imune mediada por uma diabetes resulta de uma perda devastadora de células-β produtoras de insulina, a secreção de insulina das células β prejudicada e sinalização da insulina periférica na diabetes tipo 2 em conjunto promover hiperglicemia, dislipidemia e aumento da produção hepática de glicose, o que acaba por resultar em tanto a perda da capacidade de destruição de células β e secreção de insulina a partir de células individuais β-3. Compreender os mecanismos de células-β subjacentes a progressão da diabetes tipo 1 e 2, esperamos dar origem a novas terapias para prevenir e tratar estas doenças. In vitro timodelos de cultura ssue, tais como o INS-1 e MIN6 linhas de células imortalizadas β, podem ser ferramentas úteis para a compreensão da função das células β específicos. No entanto, as interações entre os diferentes tipos de células dentro da ilhota-se pode regular a função das células β. Por exemplo, a influência parácrina de glucagon (libertado a partir de células-α) e somatostatina (libertado a partir de células-δ) em aumentar e diminuir a secreção de insulina, respectivamente, demonstra a importância da proximidade de células de células na resposta endócrina 4. Além disso, junções entre as células-β potencializar a liberação de insulina 5. Além disso, embora tenham sido feitos progressos na geração de linhas de insulinoma que melhor replicados a resposta fisiológica de ilhéus isolados de glicose (por exemplo, o INS-1 derivado de 832/13 e 832/3 linhas de células), a sua capacidade de resposta de glucose ainda difere do normal de rato ilhotas 6,7. Além disso, a resposta destas linhas celulares de insulinoma clonaisa peptide-1 (GLP-1) agonistas de glucagon-like pode variar drasticamente de uma outra, bem como a partir de ilhéus normais 6. Portanto, as linhas de células imortalizadas podem não representar o melhor modelo para os agentes de ensaio que o impacto sobre a produção de cAMP. Em contraste com as linhas de células derivadas de insulinoma, estudar a função das células β exclusivamente em modelos animais completos oferece o seu próprio conjunto de complicações. Um dos maiores desafios no trabalho com tecido endócrino está medindo a concentração precisa de hormônio liberado. Especificamente, o fígado desempenha um papel importante metabolizar a insulina, e o fluxo de sangue pâncreas vai directamente para o fígado. Assim, uma medição de insulina no plasma podem não descrever com precisão a quantidade de insulina a ser segregadas a partir da própria pâncreas ou o impacto de diferentes tratamentos sobre a taxa de secreção de insulina 8. Além disso, o metabolismo renal do glucagon pode limitar a confiabilidade da produção de glucagon a partir de células dos ilhéus α-9. Portanto, isolar ilhotas principal do mouse para a experimentação in vitro proporciona uma compreensão mais precisa de como a ilhota está respondendo a estímulos específicos para complementar as medições feitas in vivo. O presente protocolo para o isolamento de ilhotas de rato é um protocolo bem estabelecido usado por um número de grupos (com pequenas modificações que podem ajudar a aumentar o sucesso) 10,11. Além disso, a determinação da produção de cAMP permite uma leitura directa da capacidade de resposta das células incretina-β. Em conjunção com a medição de cAMP, teor de proteína e a secreção de insulina pode também ser quantificada a partir da mesma preparação de amostras de cAMP, ajudando a determinar se um defeito na função das células-β reside proximal ou distal em AMPc 10. O conteúdo cAMP final e aplicação da secreção de insulina neste protocolo pode ser uma ferramenta muito poderosa para a compreensão da influência de componentes farmacêuticos e dietéticos, entre outross, em cAMP e secreção de insulina. Além disso a estimulação da glucose sozinha, outros compostos podem ser utilizados para medir as alterações do cAMP e secreção de insulina 10,11. Finalmente, embora a insulina é a hormona primária que ensaiar a partir de ilhotas isoladas, outras hormonas, como o glucagon e somatostatina, assim como citoquinas, e eicosanóides, o monofosfato cíclico de adenosina, pode também ser medida, quer por um ensaio de estimulação transitória ou por quantificação de os seus níveis no meio de cultura 12. Finalmente, embora fora do âmbito deste manuscrito, isolamento de ilhotas com o método de isolamento da colagenase descrita permite a preservação da ilhota de forma que muitas outras aplicações a jusante, pode ser exercida, tal como o transplante de ilhotas, para isolamento de RNA por PCR quantitativo em tempo real ou de microarray análises de proteínas isolamento por Western blot, dos ilhéus incorporação e imagiologia de imunofluorescência, e incorporação de [3H]-timidina como medida de repli antiilhotascação, alguns dos quais têm sido descritas em artigos anteriores JoVE 13-16. No geral, seguindo o procedimento de isolamento das ilhotas descritos no protocolo pode fornecer um pesquisador com informações importantes e úteis para o desenvolvimento de terapias e promover a descoberta de medicamentos destinado a melhorar a função das células β.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="502">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:235px;">Collagenase: Collagenase from Clostridium histolyticum suitable for isolating active islets</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">C7657</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Ficoll 400</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9378</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Hanks Balanced Salt Solution 10X</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen (Gibco)</td>
			<td>14065-056</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Hepes</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">RPMI 1640 (powder)</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen (Gibco)</td>
			<td style="width:136px;">31800-022</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Albumin from Bovine Serum (BSA)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7888</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">3/0 Silk Suture Thread</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td>18020-30</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">0.8 mm Forceps&#160;&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools&#160;&#160;</td>
			<td style="width:136px;">11050-10</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Curved Scissors</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools&#160;&#160;</td>
			<td style="width:136px;">14061-10</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:235px;">Vannas-T&#252;bingen Spring Scissors - Straight/Sharp/8.5 cm/5 mm Cutting Edge</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">15003-08</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Dissecting Scissors</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools&#160;&#160;</td>
			<td style="width:136px;">14002-14</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">5ml BD Luer-Lok Syringe</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td style="width:136px;">309646</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">1ml BD syringe</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td style="width:136px;">309628</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">30 G BD Needle 1/2&#34; Length</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td style="width:136px;">305106</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">27 G BD Needle 1/2&#34; Length</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td style="width:136px;">305109</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Sharpening Stone</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">29008-01</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">2-2-2 tribromoethanol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">T48402-25G</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">2-methyl-2-butanol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>240486-100mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:235px;">Monopotassium Phosphate (KH2PO4)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">P0662</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:235px;">Sodium Bicarbonate (NaCHO3)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">S6014</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:235px;">CaCl2 *2H2O</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">C3881</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:235px;">MgSO4 *7H2O</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">M9397</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen (Gibco)</td>
			<td style="width:136px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:235px;">Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">SH30088.03HI</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">5879-100MG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular camp determination

Glicemia descontrolada é uma característica da diabetes mellitus e promove morbidades como neuropatia, nefropatia e retinopatia. Com o aumento da prevalência de diabetes, tanto imunomediada tipo 1 e ligado à obesidade do tipo 2, estudos que visam delinear fisiopatologia diabetes e mecanismos terapêuticos são de importância crítica. As células-β dos ilhéus pancreáticos de Langerhans são responsáveis ​​pela apropriadamente secretoras de insulina, em resposta a concentrações elevadas de glicose no sangue. Em adição à glucose e outros nutrientes, as células-β também são estimulados por hormonas específicas, denominado incretinas, que são secretadas a partir do intestino em resposta a uma refeição e agem em receptores de células β que aumentam a produção intracelular de monofosfato de adenosina cíclico ( cAMP). Diminuição da função das células-β, massa e capacidade de resposta incretina são bem compreendidos a contribuir para a fisiopatologia do diabetes tipo 2, e também estão sendo cada vez mais ligada wiª diabetes tipo 1. O presente rato isolamento ilhéu e protocolo determinação cAMP pode ser uma ferramenta para ajudar a delinear os mecanismos que promovem a progressão da doença e intervenções terapêuticas, particularmente aquelas que são mediadas pelos receptores de incretinas ou receptores que atuam através da modulação da produção de cAMP intracelular relacionados. Embora apenas as medições de cAMP será descrito, o protocolo de isolamento de ilhotas descrito cria uma preparação limpa, que permite também a muitas outras aplicações a jusante, incluindo a glicose estimulou a secreção de insulina, [3 H]-timidina, a abundância de proteínas, e a expressão do mRNA.

Para garantir um alto rendimento ilhota durante o isolamento, as técnicas cirúrgicas descritas no protocolo deve ser seguido de perto. Embora as técnicas apresentadas aqui vai ser adaptado para cada laboratório, existem alguns passos críticos que levarão a um isolamento bem sucedido. A fim de tornar o canal biliar comum de fácil acesso, recomenda-se que os órgãos de ser deslocado para o lado direito do rato (Figura 1). Além disso, isto irá permitir que o pâncreas são accionados com uma quan...

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A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Ensaiando in vitro a função das células β usando o mouse ilhotas isoladas de Langerhans é um componente importante no estudo da fisiopatologia do diabetes e terapêutica. Embora muitas aplicações a jusante estão disponíveis, este protocolo descreve especificamente a medida da intracelular monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) como um parâmetro essencial para definir a função das células β.

Um Método para Mouse ilhotas pancreáticas Isolamento e intracelular cAMP Determinação

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Research

JoVE Journal

Biology

Murine Pancreatic Islet Isolation

Isolamento Islet murino de pâncreas

Biologia

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Isolamento Islet humana Pancreatic: Parte I: Digestão e Coleta de tecido pancreático

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Isolamento Islet humana Pancreatic: Parte II: Purificação e Cultura de Ilhotas Humanos

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

Assistida por computador visualização de grande escala e Quantificação da Missa das ilhotas pancreáticas, distribuição de tamanho e Arquitetura

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

Rato Ilhéu de Langerhans isolamento usando uma combinação de colagenase purificada e Protease Neutra

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolamento e Cultura do mouse primárias células pancreáticas acinares

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Near Infrared (NIr) Light Increases Expression of a Marker of Mitochondrial Function in the Mouse Vestibular Sensory Epithelium

Near Infrared NIr Light Increases Expression of a Marker of Mitochondrial Function in the Mouse Vestibular Sensory Epithelium

Infravermelho Próximo (NIR) Luz aumenta a expressão de um marcador da função mitocondrial no mouse Vestibular Sensorial Epithelium

Strategies for attenuating decline in balance function with increasing age are predominantly focused on physical therapies including balance tasks and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Isolamento e Cultura de Queratinócitos de Rato Primário de Pele de Rato Neonatal e Adulto

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Um protocolo de alta eficiência simples para isolamento de Islet pancreático de camundongos

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse

Um método de transplante de ilhotas para o omento no Mouse

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet ...