Name: free radicals in chemical biology: from chemical behavior to biomarker development
Uploaded: 2013-04-15T13:00:00
Duration: 14 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Free Radicals in Chemical Biology: from Chemical Behavior to Biomarker Development at JoVE.com

Ekonomiskt stöd från Ministero dell&#39;Istruzione, dell&#39;Universita della Ricerca (prin-2009K3RH7N_002) och Marie Curie Intra-European Fellowship (CYCLOGUO-298.555) samt sponsring av COST Action CM0603 om &quot;fria radikaler i kemisk biologi och COST Action CM1201 om &quot;Biomimetic Radical Chemistry&quot; tas tacksamt erkänt.

1. Syntes av mono-trans-isomerer av kolesterylestrar <ol><li> Lös kolesterylestrar (linoleat eller arakidonat kolesterylester) i 2-propanol (15 mM). För en bättre solubilisering proverna sonikerades under 15 minuter under argon. </li><li> Överför lösningen till en kvarts fotokemisk reaktor, tillsätt 2-merkaptoetanol i 2-propanol (för att nå 7 mM koncentration, från en 2 M förrådslösning av tiolen). Spola reaktionsblandningen med argon under 20 minuter för att eliminera närvaron av syre i lösningen. </li><li> Bestråla reaktionsblandningen med UV-ljus med användning av en 5,5 W lågtrycks-kvicksilverlampa vid 22 ± 2 ° C under 4 minuter. Monitor av analytisk Ag-TLC (silver-tunnskiktskromatografi) att bevisa bildandet av mono-trans kolesterylestrar (se figur 1 för kemiska formlerna). TLC färgningen utförs genom att hälla plattan i cerium ammonium molibdate (CAM)-lösning, och fläckar på uppvärmningplattan. Släck reaktionen vid ett tidigt stadium, i syfte att återvinna utgångsmaterialet, som kan återanvändas för att utföra andra omgångar av isomerisering, erhålla en ökning av det totala utbytet. </li><li> Samla reaktionsblandningen i en rundbottnad kolv, tvätta anordningen med några ml 2-propanol. Avlägsna lösningsmedlet och rena mono-transisomerer av kolesterylestrar från Ag-TLC som beskrivits i litteraturen. 5 Använd hexan-dietyleter (9:1 v / v) som eluent för mono-trans-kolesteryllinoleat isomerer, medan användning hexan -dietyleter-ättiksyra (9:1:0,1 volym / volym) för mono-trans kolesteryl arakidonat-isomerer. </li></ol> 2. Isolering av kolesterylestrar Fraktion från humant serum <ol><li> Späd 1 ml av humant serum (erhållen genom centrifugering av blod) med 1 ml saltlösning och häll lösningen i en separationstratt under en ström av argon för att undvika artefakter (t.ex. oxidation addukter). Tillsätt 10 ml kloroform-metanol (2: 1 vol / vol) tre gånger. Skaka separationstratten mycket långsamt för att begränsa bildningen av emulsionen på grund av närvaron av albumin. </li><li> Tvätta de organiska skikten en gång med saltlösning (10 ml), sedan samlas i en Erlenmeyer-kolv under ett argonflöde, torka över vattenfritt natriumsulfat. Avlägsna flyktiga ämnen från rotationsindunstare för att ge en gul olja (totalt plasma lipidfraktionen). </li><li> Ta upp den råa med 1 ml kloroform-metanol (2:1 volym / volym), belastning på en preparativ TLC under en ström av argon och använda en blandning av hexan-dietyleter (9:1 v / v) som elueringsmedel . Skrapa av kiseldioxiden del som innehåller kolesterylester-fraktionen och häll i en flaska. Därefter extrahera kiseldioxid (3 x 5 ml) med kloroform-metanol (2:1 volym / volym), samla de organiska skikten och avlägsna lösningsmedlet efter indunstning för att ge den rena fraktionen av kolesterylestrar (vanligtvis ~ 1,5 mg). </li><li> Förvara kolesterylestrar i en mörk flaska täckt av aluminiumfolie under argon och förvara vid -20 ° C. Kolesteryl esters är känsliga för ljus och syre. </li></ol> 3. Karakterisering av Mono-trans kolesterylestrar av Raman-spektroskopi <ol><li> Utdrag kolesterylestrar från humant serum (≥ 0,7 mg) som beskrivs i avsnitt 2, lös upp i en liten mängd koltetraklorid (≤ 10 pl) och placera i en injektionsflaska. CCl 4 väljs som lösningsmedel eftersom dess ramansignalen inte överlappar med det intressanta området av kolesterylester analys. </li><li> Överför lösningen till provhållaren genom en disponibel glaspipett, sedan försiktigt avlägsna lösningsmedlet genom en långsam ström av argon. När en enhetlig oljig film bildas på den inre väggen av provhållaren, placera den senare i instrumentet för mätning. </li><li> Fourier-transformeras Ramanspektrum av kolesterylestrar direkt erhålls på lipid extrakt utan derivatiseringsreaktion. Lasereffekten på provet är &lt;100 mW för att undvika prov skador. Det totala antalet avsökningarför varje spektrum är ≥ 800 för att minimera bakgrundsbruset. </li><li> Det 1,700-1,630 cm -1 utbud av Raman spektrat analyseras eftersom den återspeglar bidrag från C = C dubbelbindningar finns i molekylen (C = C stretching läge). En kurvanpassning analys utförs på denna region, vilket möjliggör särskiljande av de överlagrade bidrag från cis-och trans-dubbelbindningar i fet alkylkedjan och dubbelbindning i ringen B kolesterol (se figur 2). </li><li> För att passa korrekt vibrational banden bör vissa parametrar fastställas eller begränsas inom rimliga gränser. De ingående topp profilerna beskrivs som en linjär kombination av Lorentz och Gaussiska funktioner, medan halv-höjd bandbredder bäst bestäms av datorn optimering rutinen. Antalet och placeringen av komponenter topparna erhålls genom att använda den fjärde derivatan spektra, som gör det möjligt att upptäcka också några svaga komponenter band. Eftersom signalenbrusförhållande som försämras vid differentiering av signalen kan utesluta användningen av den fjärde derivatet, slätade 4. derivat med tretton punkter Savitsky-Golay funktionen är av fördel, varför en rätt kompromiss mellan upplösning och signal-brus-förhållande som erhålls . Bästa kurvanpassning erhålls till lägsta möjliga c 2 värden. </li><li> Närvaron av trans-isomerer avslöjas av komponenten vid 1671 ± 1 cm -1, förutom åtminstone de två komponenterna, något skiftat mot lägre frekvenser, på grund av den fettsyrakedjan och kolesterol C = C dubbelbindningar. Representativ Ramanspektrum av plasma kolesterylester visas i figur 9. I insättningen jämförelsen av en specifik region med kolesteryllinoleat och mono-trans-kolesteryl linolsyra isomerer visas. </li></ol> 4. Derivatisering till fettsyrametylestrar (FAME) och analys med gaskromatografi <ol><li> Löskolesterylestrar (~ 1,5 mg) med 0,5 ml av en 1 M lösning av natriumhydroxid i bensen-metanol (2:3 volym / volym) och placera i en mörk flaska täckt av aluminiumfolie under argon. </li><li> Låt blandningen omröring vid rumstemperatur och övervaka med TLC med användning av en blandning av hexan-dietyleter (9:1 v / v) som elueringsmedel. Reaktionstiden är vanligen 30 min men en noggrann reaktion övervakning krävs. I själva verket, när motsvarande metylestrar bildas, måste reaktionen släcktes för att undvika bildningen av nedbrytnings-och biprodukter. TLC visade den kvantitativa bildningen av metylestrar. </li><li> Släck reaktionsblandningen genom tillsats av 1 ml saltlösning och extrahera metylestrar med n-hexan (3 x 2 ml). Samla de organiska skikten i en ampull och avlägsna lösningsmedlet genom rotationsindunstning för att ge fraktionen metylester, som sedan används för GC-analys utan ytterligare rening. </li><li> Lös metylestrarna i minsta möjliga mängd av n-hexan (vanligen 1 mg i 50 il) och injicera i GC utrustad med en 60 m x 0,25 mm x 0,25 ^ m (50%-cyanopropyl)-metylpolysiloxan kolonn. Använd en detektor flamjonisering (FID) med följande ugnen programmet: temperatur startar vid 165 ° C, håll under 3 min, följt av ökning av 1 ° C / min upp till 195 ° C, håll under 40 min, följt av en andra ökning av 10 ° C / min upp till 240 ° C och håll under 10 min. Ett konstant tryck läge (29 psi) väljs. Helium eller väte kan användas som bärargas. Metylestrar identifieras genom jämförelse med retentionstiderna för autentiska prover. Figur 10 visar en representativ GC-analys av FAME erhållen från plasma kolesterylestrar. </li></ol> 5. Syntes av (5&#39;R) - och (5&#39;S) -5 &#39;,8-cyklo-2&#39;-deoxiadenosin <ol><li> Lös 33 mg 8-brom-2&#39;-deoxiadenosin (8-Br-dAdo) i acetonitril (100 ml) för att nå 1 mM koncentration. Reglera gasflödet (Ar eller N2) i fotoreaktom och fylla apparatus med lösning av 8-Br-dAdo. </li><li> Förbered ett septum med lämplig storlek för fotoreaktom insatser och passera en nål ansluten till den inerta gasen linje genom centrum av den. Stäng systemet med septumet. Spola den inerta gasen under 30 min. </li><li> Bestråla med UV-ljus med användning av en 125W medelhög kvicksilverlampa vid 22 ± 2 ° C under 15 minuter, samla upp lösningen till en 250 ml rundbottnad kolv. Tvätta fotoreaktom med 10 ml acetonitril och samla sköljvattnet i samma kolv. </li><li> Släck råa reaktionsblandningen med 1 M NH 4 OH-lösning och indunsta lösningsmedlet i rotationsindunstare. </li><li> Kör HPLC-analys (HPLC-UV) med analytisk kolonn (se instrumentering avsnitt) under kända förhållanden, och jämföra profilen med referensföreningar. </li><li> Kör högpresterande analys vätskekromatografisk (HPLC-UV) med en analytisk kolonn (se avsnitt instrumentering) genom att använda följande solenventiler och gradienter: 2 mM ammoniumformiat som lösningsmedel A och acetonitril som lösningsmedel B. Ställ flödeshastigheten till 1 ml / min och gradienten från 0% lösningsmedel B till 0,3% lösningsmedel B som skall nås i 2,2 minuter. Därefter 0,8% lösningsmedel B i i 4,0 minuter, därefter 1% lösningsmedel B under 4,8 min. Kvar på 1% lösningsmedel B för 9 minuter och sedan gå till 8% lösningsmedel B i 6 min. Efter gå till 10% lösningsmedel B i 4 min och till 30% lösningsmedel B i 5 minuter och förbli vid 30% lösningsmedel B under andra 5 minuter. Samla de kromatografiska toppar som motsvarar de två diastereomera produkterna i två olika flaskor. </li><li> Mät absorbansen hos de uppsamlade två fraktionerna i UV-spektrofotometer och beräkna den exakta koncentrationen baserad på Lamber-Beers lag (A = εlC, där A är absorbansen, ε extinktionskoefficienten och L längden av cellen). Använd ε extinktionskoefficienten av 2&#39;-deoxiadenosin (dAdo) (15.400 M -1 cm -1 vid 260 nm). </li></ol> 6. Syntes av (5&#39;R) - end (5&#39;S) -5 &#39;,8-cyklo-2&#39;-deoxiguanosin <ol><li> Lös 35 mg 8-brom-2&#39;-deoxiguanosin (8-Br-dGuo) och 30 mg natriumjodid (Nal) i destillerat vatten (100 ml) för att nå 1 mM och 2 mM koncentration, respektive. Reglera inert gas (Ar eller N 2) flöde anslutet till fotoreaktom och fyll fotoreaktom med reaktionslösningen. </li><li> Degass reaktionsblandningen såsom beskrivits i förfarande 5 (steg b). </li><li> Bestråla med UV-ljus med användning av en 125W medelhög kvicksilverlampa vid 22 ± 2 ° C under 30 minuter, samla upp lösningen till en 250 ml rundbottnad kolv. Tvätta fotoreaktom med 10 ml vatten och samla sköljvattnet i samma kolv. </li><li> Släck råa reaktionsblandningen med 1 M NH 4 OH-lösning och indunsta lösningsmedlet under vakuum. </li><li> Gör analysen som beskrivs i förfarande 5 (steg E till G). Använd ε extinktionskoefficienten av 2&#39;-deoxiguanosin (dGuo) (11.700 M -1 cm -1 vid 260 nm). </li></ol> 7. Syntes av märkt Isotopic purin (5&#39;R) - och (5&#39;S) -5 &#39;,8-cyclonucleosides <ol><li> Bered 2 ml av 1 mM vattenlösning (destillerat vatten) av de märkta 15 N isotopisk purinnukleosider ([15N 5] dAdo eller [15N 5] dGuo) i en glasampull (4 ml) med en septumlock. </li><li> Anslut flaskan med septumlock och ansluta till gasledningen (N 2 O för mättnad av lösningen) genom en nål i septum som når botten av flaskan. En annan kort nål i septumlock fungerar som gasutgången. </li><li> Spola lösningen med N 2 O för 30 minuter. Gasflödet regleras att vara mycket låg. </li><li> Avfarten nål först tas ut och efter 1 &#39;det lång följer, i syfte att få en liten tryck inuti flaskan. </li><li> Sätt lösningen i apparaten av gamma radiolys för 8 timmar (beräkning på grundval av en dosrat ca. 4,5 Gy / min). </li><li> Efter reaktion släcka den råa med 1 M NH 4 </sUB&gt; OH-lösning. </li><li> Kör HPLC-analys (HPLC-UV) under kända förhållanden, 6 och jämföra kromatogrammet med de standardverk. </li></ol> 8. Gamma Radiolys av DNA vattenlösningar <ol><li> Bered 1 ml av 0,5 mg / ml lösning (destillerat vatten) av kalvtymus-DNA och placerades i en glasampull (2 ml) med ett septum lock. </li><li> Degass reaktionen som beskrivits i förfarande 7 (steg bd). </li><li> Sätt lösningen i apparaten av gamma radiolys under 30 min (beräkning på basis av dos / kurs ca. 4,5 Gy / min). </li></ol> 9. Enzymatisk digerering av DNA <ol><li> Till ett Eppendorf-rör innehållande 80 ng DNA, tillsätt 8 U nukleas P1, 0,01 U fosfodiesteras II, 20 nmol EHNA i 20 pl 300 mM natriumacetat (pH 5,6) och 10 mM zinkklorid. Inkubera blandningen vid 37 ° C under 48 timmar. </li><li> Lägg sedan till en blandning av 8 U alkaliskt fosfatas, 0,02 U phosphodiesterase I, i 40 pl 0,5 M Tris-HCl-buffert (pH 8,9) till blandningen digerering. Provet inkuberas vid 37 ° C under 2 timmar. </li><li> Blandningen neutraliseras genom tillsats av 10% myrsyra. </li><li> Överför provet till en Amicon Ultra-0,5 centrifugalfilter enhet (cutoff 3 kDa), tillsätt 200 pl tridistilled H 2 O. Placera Ultra-filtret i centrifugrotorn vid 14.000 xg under 15 minuter. Sedan separera Ultra filteranordningen från mikrocentrifugrör. Lyofilisera enzymfri lösning i mikrocentrifugrör. </li></ol> 10. DNA-prov avsaltning före analysen <ol><li> Kör HPLC-analys (HPLC-UV) med analytisk kolonn (se instrumentering avsnitt) efter kända förhållanden. 6 </li><li> Lös den lyofiliserade digererade DNA i 20 pl H-2 O och injicera i HPLC-UV. </li><li> Samla upp provet i en flaska efter salteluering (första minuter) och precis innan elueringen time av den första nukleosiden (5&#39;R-cdGuo), fram till slutet av den kromatografiska programmet. </li><li> Provet lyofiliseras och återupplöses i 20 | il vatten. </li></ol> 11. LC-MS/MS Kvantitativ analys <ol><li> Förbered HPLC-MS/MS (trippelkvadrupolmasspektrometer) innan analysen genom att ladda den analytiska metoden och metoden för MS-detektor (ESI). 6 </li><li> Tillsätt 1 pl av den märkta isotopiska föreningar blandningen i det färdiga provet Procedur 7. </li><li> Injicera 20 ul av den digererade spetsade DNA-lösning i destillerat vatten. </li><li> De erhållna kromatografiska data utarbetas på grundval av tidigare kalibrering med referensföreningar. En representativ HPLC-körning innehåller adenosin och guanosin 2&#39;-deoxiribonukleosider och deras oxidativa och derivat cyclo visas i figur 11. </li></ol>

<ol>
	<li>Ferreri, C., Chatgilialoglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+lipidomics+and+the+geometry+of+unsaturated+fatty+acids:+from+biomimetic+models+to+biological+consequences.">Membrane lipidomics and the geometry of unsaturated fatty acids: from biomimetic models to biological consequences.</a> Methods Molecular Biology. 579, 391-412 (2009).</li><li>Chatgilialoglu, C., Ferreri, C., Terzidis, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purine+5',8-cyclonucleoside+lesions:+chemistry+and+biology.">Purine 5',8-cyclonucleoside lesions: chemistry and biology.</a> Chemical Society Reviews. 40 (3), 1368-1382 (2011).</li><li>Chatgilialoglu, C., Ferreri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+reductive+modifications+of+sulfur-containing+amino+acids+within+peptides+and+proteins.">Radiation-induced reductive modifications of sulfur-containing amino acids within peptides and proteins.</a> Journal of Proteomics. 74 (11), 2264-2273 (2011).</li><li>Chatgilialoglu, C., Ferreri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans+lipids:+the+free+radical+path.">Trans lipids: the free radical path.</a> Accounts Chemical Research. 38 (6), 441-448 (2005).</li><li>Melchiorre, M., Torreggiani, A., Chatgilialoglu, C., Ferreri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+markers+of+geometrical+radical+stress:+synthesis+of+mono-trans+cholesteryl+esters+isomers+and+detection+in+human+plasma.">Lipid markers of geometrical radical stress: synthesis of mono-trans cholesteryl esters isomers and detection in human plasma.</a> Journal of the American Chemical Society. 133 (38), 15184-15190 (2011).</li><li>Wang, J., Yuan, B., Guerrero, C., Bahde, R., Gupta, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Oxidative+DNA+Lesions+in+Tissues+of+Long-Evans+Cinnamon+Rats+by+Capillary+High-Performance+Liquid+Chromatography-Tandem+Mass+Spectrometry+Coupled+with+Stable+Isotope-Dilution+Method.">Quantification of Oxidative DNA Lesions in Tissues of Long-Evans Cinnamon Rats by Capillary High-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Coupled with Stable Isotope-Dilution Method.</a> Analytical Chemistry. 83 (6), 2201-2209 (2011).</li><li>Boussicault, F., Kaloudis, P., Caminal, C., Mulazzani, Q. G., Chatgilialoglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+C5'+radicals+of+purine+nucleosides+under+oxidative+conditions.">The fate of C5' radicals of purine nucleosides under oxidative conditions.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (26), 8377-8385 (2008).</li><li>Ferreri, C., Kratzsch, S., Brede, O., Marciniak, B., Chatgilialoglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans+lipids+formation+induced+by+thiols+in+human+monocytic+leukemia+cells.">Trans lipids formation induced by thiols in human monocytic leukemia cells.</a> Free Radicals Biology &amp; Medicine. 38 (9), 1180-1187 (2005).</li><li>Zambonin, L., Ferreri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+trans+fatty+acids+in+rats+fed+a+trans-free+diet:+a+free+radical-mediated+formation.">Occurrence of trans fatty acids in rats fed a trans-free diet: a free radical-mediated formation.</a> Free Radicals Biology &amp; Medicine. 40 (9), 1549-1556 (2006).</li><li>Puca, A. A., Andrew, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acids+profile+of+erythrocyte+membranes+as+possible+biomarker+of+longevity.">Fatty acids profile of erythrocyte membranes as possible biomarker of longevity.</a> Rejuvenation Research. 11 (1), 63-72 (2008).</li><li>Belmadoui, N., Boussicault, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+formation+of+purine+5',8-cyclonucleosides+in+isolated+and+cellular+DNA:+high+stereospecificity+and+modulating+effect+of+oxygen.">Radiation-induced formation of purine 5',8-cyclonucleosides in isolated and cellular DNA: high stereospecificity and modulating effect of oxygen.</a> Organic &amp; Biomolecular Chemistry. 8 (14), 3211-3219 (2010).</li><li>Chatgilialoglu, C., Bazzanini, R., Jimenez, L. B., Miranda, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(5'S)-+and+(5'R)-5',8-cyclo-2'-deoxyguanosine:+mechanistic+insights+on+the+2'-deoxyguanosin-5'-yl+radical+cyclization.">(5'S)- and (5'R)-5',8-cyclo-2'-deoxyguanosine: mechanistic insights on the 2'-deoxyguanosin-5'-yl radical cyclization.</a> Chemical Research in Toxicology. 20 (12), 1820-1824 (2007).</li><li>Wang, J., Clauson, C. L., Robbins, P. D., Niedernhofer, L. J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oxidative+DNA+lesions+8,5'-cyclopurines+accumulate+with+aging+in+a+tissue-specific+manner.">The oxidative DNA lesions 8,5'-cyclopurines accumulate with aging in a tissue-specific manner.</a> Aging Cell. 11 (4), 714-716 (2012).</li><li>Ferreri, C., Chatgilialoglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+fatty+acid-based+functional+lipidomics+in+the+development+of+molecular+diagnostic+tools.">The role of fatty acid-based functional lipidomics in the development of molecular diagnostic tools.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 12 (7), 767-780 (2012).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

Omvandlingen av naturligt förekommande cis omättade fettsyror till geometriska trans-isomerer är en transformation i samband med produktionen av radikala stress i den biologiska miljön. Cell membranlipider, som innehåller fettsyror, är en relevant biologiskt mål för radikal stress och vi först studerat endogena cis-trans isomerisering fosfolipider i cellkulturer, djur och människor bedöma analytiska protokoll i varje fall. 8-10 Vi visade att denna omvandling kan ske genom en mängd av S-innehållande föreningar, inkluderande tioler, tioetrar och disulfider, som under olika radikala stressförhållanden har möjlighet att generera thiyl radikaler, dvs isomerisering medlet (figur 3). Exemplet som visas i denna artikel fokuserar på klassen av kolesterylestrar, vilka representerar en välkänd fraktion av plasmalipider, strikt involverade i lipoproteinmetabolism. Esterbindningen mellan fettsyror och cholesterol biosyntetiseras genom överföring av fettsyror från läget 2 i glyceroldelen av fosfatidylkolin till kolesterol, ett steg katalyseras av enzymet lecitin kolesterol acyltransferas (LCAT). Därför plasma kolesterylestrar strikt samband med membranlipid omsättning, och innehåller relativt höga proportioner av de fleromättade fettsyror (PUFA) typiskt närvarande i fosfatidylkoliner, dvs linolsyra och arakidonsyra syror. Lipoprotein bildas är involverat i kardiovaskulära och metabola sjukdomar. Reaktiviteten av naturliga kolesterylestrar med fria radikaler kan uppstå vid dubbelbindningar i linoleat och arakidonat rester som kan omvandlas i motsvarande trans geometriska isomerer (se figur 1 för strukturerna). Karakterisering av det transeuropeiska kolesterylester innehåll i biologiska prover är intressant för biomarkör utveckling. En indirekt metod består av omvandlingen av cholesteryl estrar isolerats från plasma till motsvarande fettsyrametylestrar (FAME) och separation genom protokoll gaskromatografiska. I detta fall, är kalibreringen av de standardverk av cis-och trans-fettsyra-metylestrar utförs, i syfte att möjliggöra kvantifiering av trans-halten i proverna. Baserat på de analytiska studier som utförts på kolesterylester-biblioteket föreslog vi att gälla även en metod baserad på Ramanspektroskopi, som kan utföras direkt på kolesterylester fraktionen isolerad från plasma, utan ytterligare derivatisering till motsvarande FAME (se figur 2 och 9). Det är värt att notera att upp nu inga framgångsrika metoder beskrivs för att separera cis-och trans-isomerer av fettsyror innehållande lipider med HPLC, som istället beskrivs av kolesterylester hydroperoxider. Hittills är den indirekta gaskromatografiska metoden fortfarande den bästa tillgängliga metoden hittills. Genom denna metod den första kvantitativa utvärdering av mono-trans-innehåll som härrör från kolesterylestrar isolerade från plasma från friska försökspersoner tillhandahölls. Använda Detector flamjonisering (FID) gränsen för detekterbarhet är tillfredsställande (ppb) och nanomolära mängder av föreningarna har upptäckts. 5. Med olika detektionssystem denna gräns kan även sänkas. Effekten av joniserande strålning på kolesterylestrar är fråga om ytterligare studier, om ett linjärt svar erhålles i förhållande till den applicerade dosen. Som ett andra exempel har vi valt modifierade nukleosider vilka kan framställas genom fri radikal skada av DNA. Hydroxylradikaler (HO •) är kända för att vara de mest skadliga reaktiva syreradikaler (ROS) för deras förmåga att orsaka kemiska modifieringar till DNA. Enkla eller multipla lesioner kan förekomma på DNA, att i eukaryota celler är beläget i kärnan och mitokondrier. Identifiering och mätning av de viktigaste klasserna av oxidativa genererade skador till DNA kräver approprIate molekylära bibliotek i syfte att upprätta de analytiska protokoll. Vi fokuserade vårt intresse på de minsta tandem lesioner, vilka är purin 5 &#39;,8-cyklo-2&#39;-deoxiribonukleosider, har en ytterligare kovalent bindning mellan basen och sockerdelar som skapas av den fria radikalen attacken. Föreningarna är 5 &#39;,8-cyklo-2&#39;-deoxiadenosin och 5 &#39;,8-cyklo-2&#39;-deoxiguanosin existerar i 5&#39;R och 5&#39;S diastereomera former (Figur 5). Deras potential att bli fri radikal stressen markör är fråga om grundforskning. 2 Det är när DNA utsätts för HO • radikala väte abstraktion från C5 ställning för sockret en av de möjliga händelser som ledde till bildandet av dessa tandem skador. Purin 5 &#39;,8-cyclonucleosides kan mätas som summan av diastereomerer genom HPLC-MS/MS i enzymatiskt spjälkade γ-bestrålade DNA-prover varierar från 1 till 12 lesioner / 10 6 nukleosider / Gy går formen frånvaro av syre till fysiologisk nivå av syre Jagn vävnader, den diastereomera förhållandet 5&#39;R / 5 är att vara ~ 4 och ~ 3 för 5 &#39;,8-cdAdo och 5&#39; ,8-cdGuo respektive (figur 11). 11 Det är värt att notera att förhållandet mellan stråldos och 5 &#39;,8-cdAdo och 5&#39; ,8-cdAdo lesioner upptäcktes i cellulär DNA är långt ifrån klarlagda. Den enda experiment bygger på 2kGy bestrålning rapporterats i den experimentella kan inte anses avgörande. 11 Ytterligare experiment av detta slag och analytiska kvantifiering av de fyra lesioner är nödvändiga för att definiera en sådan relation. Detekteringen av dessa lesioner och de mer populära oxidativa omvandlingar (såsom 8-oxo-2&#39;-deoxiguanosin, 8-oxodGuo) är fråga om intensiva undersökningar, som visar att betydelsen av båda lesioner under oxidativ metabolism. 6,13 Användningen av HPLC -MS/MS (trippelkvadrupolmasspektrometer) har en detektionsgräns nära 30fmol för alla fyra lesioner. Sista förbättringar påstås nå detektionsgränser attomol nivåer av instrumentet produCER. Baserat på den allra senaste litteraturen, 6 analysmetoder måste innehålla rätt sanering av provet och anrikning i syfte att möta detektionsgränser MS / MS / MS (jonfälla) eller MS / MS användes (trippelkvadrupolmasspektrometer) i vårt fall. Bio-inspirerade syntetiska förfaranden av föreningar 1-4 utvecklades utgående från 8-bromopurine derivat enligt eller fotolys. 7,12 Dessa förfaranden inbegriper en radikal kaskadreaktion som härmar mekanismen DNA-skada av bildning av 5 &#39;,8-cdAdo och 5&#39; ,8-cdGuo lesioner. Från biologiska perspektiv, visade det sig att dessa skador ackumuleras med åldrande i ett vävnadsspecifikt sätt (lever&gt; njure&gt; hjärna), som styrker att DNA-reparation mekanismer är otillräckliga för att bevara det genetiska materialet från dessa skador. 13 Faktum nukleotid excision reparation (NER) är den enda vägen identifierade för närvarande för reparation av dessa lesioner. 2 De två Klassenes av föreningar som visas i figurerna 1 och 5 är inte kommersiellt tillgängliga för närvarande, men de syntetiska strategierna som beskrivs i litteraturen är det inte skulle vara svårt att framställa dessa föreningar för kommersiellt bruk. Den tvärvetenskapliga angreppssätt från kemisk biologi studier har inte bara ett enormt värde i att identifiera nya mekanismer som förekommer i den biologiska miljön, men också ger ett grundläggande bidrag till biomarkörer och diagnostik, slutligen föra nyhet i vård och förebyggande strategier. 14 Den kemisk bidrag behövs för en framgångsrik utveckling av molekylär medicin, skapa integrerade plattformar och paneler för metabolisk profilering som förväntas möjliggöra en optimal rationalisering av insatser utformning, antingen terapeutiska och näringsmässiga, minska osäkerheten och misslyckanden när de kan vara förutsägbar.

Reaktiviteten av fria radikaler avslöjade sin enorma betydelse för många biologiska händelser, inklusive åldrande och inflammation. Numera är det mer och mer uppenbart att klargöra varje kemisk steg inblandade i denna reaktivitet behövs för att förstå de bakomliggande mekanismerna och planerar effektiva strategier för kontroll av fria radikaler och reparation av skadan. Bidraget från kemiska studier är grundläggande, men direkta studier i den biologiska miljön kan vara svårt, eftersom överlagring av olika processer komplicerar och stör granskning av resultaten och tillhörande slutsatser. Därför har strategin att modellera fria radikalreaktioner enligt biologiskt relaterade tillstånd blivit ett grundläggande steg i forskningen om kemiska mekanismer i biologi. Under det senaste decenniet vår grupp utvecklat modeller av fria radikaler processer under biomimetiska förhållanden. I synnerhet vi envisaged biologiskt relevanta förändringar av omättade fettsyror, nukleosider och svavelhaltiga aminosyror och lägg dem i spåret som ska utvärderas och valideras som biomarkörer för hälsotillståndet. 1-4 Vår allmänna inställning består av tre moduler: <ul><li> Organisk syntes, som ger tillgång till lämpligt modifierade biomolekyler. Den syntetiska planen kan även utformas för att simulera de fria radikal processer som sker i den biologiska miljön, och följaktligen tillämpa betingelser som kan simulera den biologiska processen av intresse, vilket är principen om biomimetisk radikal kemi. I biomimetiska modeller reaktionsmediet är vatten eller ett heterogent medium på grund av samexistensen av hydrofila och hydrofoba fack. Fördelen med att arbeta med biomimetiska modeller är att ha en förenklad miljö med kända ämnen som reagerar, där reaktivitet och produkter kan granskas mer information, eventuellt upptäckanya kemiska vägar. Från detta steg mekanistiska och kinetiska information kan samlas in, </li><li> Rening, analys och karakterisering av produkterna, ger strukturell och kemisk information om de modifierade biomolekyler för att organisera molekylära bibliotek och underlätta recognition.in den mer komplexa biologiska miljön. Protokollen är etablerade även i syfte att lösa komplexa blandningar av föreningar såsom de som härrör från biologiska prover; </li><li> Biomarkör utveckling med biologiska prover, som härrör antingen in vitro experiment med cellkulturer och in vivo-studier från djur och människor. De protokoll som utvecklats i biomimetiska modeller tillämpas sedan på komplex analys av prover, att tänka de fria radikala förändringar under olika förhållanden. Molekylära bibliotek som utvecklats av syntes är av enorm hjälp för upptäckter inom life science. Den information som samlas in om de fria radikaler transformationer GIVe möjlighet att räkna ut reparations-och förebyggande strategier. Databaser av resultaten kan användas för en noggrann utvärdering av multivariat analys av biomarkörer betydelse så bra som möjligt i samband faktorer. </li></ul> Vi valde två klasser av relevanta biomarkörer att ackreditera denna strategi: kolesterylestrar och purin 5 &#39;,8-cyklo-2&#39;-deoxiribonukleosider.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>MATERIALS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cholesteryl linoleate &ge;98%</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C0289-100 mg</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cholesteryl arachidonate&ge;95% </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C8753-25mg</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> 2-mercaptoethanol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M6250-100 ml</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> 2-propanol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>34965-1L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Methanol 215 SpS </td>
 <td>Romil</td>
 <td> H409-2,5 L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Ethanol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>02860-2.5L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Chloroform SpS</td>
 <td>Romil</td>
 <td>H135 2,5 L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> n-Hexane 95% SpS</td>
 <td>Romil</td>
 <td> H389 2,5 L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Acetonitrile 230 SpS</td>
 <td>Romil</td>
 <td>H047 2,5 L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Dichloromethane SpS</td>
 <td>Romil</td>
 <td>H2022,5 L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Carbon tetrachloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>107344-1L </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Sodium iodide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>383112-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Sodium hydrogen carbonate</td>
 <td>Carlo Erba</td>
 <td>478536-500 g </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Diethyl ether</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td> 309966-1L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> NaCl</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S7653-5KG</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> NaOH solid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>221465-25G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> NH4OH sol. 28%-30%</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>221228-1L-A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Acetic acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>320099-500ML</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Ammonium Cerium(IV)sulfate dihydride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>221759-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Ammonium Molybdate tetrahydrate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A7302-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Sulfuric Acid 95%-98%</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>320501-1L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Silver Nitrate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>209139-25G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Sodium sulfate anhydrous</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>238597-500G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Nuclease P-I from penicillium citrinum</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>N8630-1VL</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Phosphodiesterase II type I-sa </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P9041-10UN</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine, hc</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E114-25MG</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Phosphatase alkaline type VII-t from*bov</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P6774-1KU</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Phosphodiesterase I type VI</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P3134-100MG</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Deoxyribonuclease II type IV from*porcin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D4138-20KU</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Trizma(r) base, biotechnology performanc ce</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>T6066-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> EDTA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E1644-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Succinic acid bioxtra</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S3674-250G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Calcium chloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C5670-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Formic acid, 98 %</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>06440-100ML</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>UFC500324</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> 8-Bromo-2'-deoxyguanosine</td>
 <td>Berry &amp; Associates</td>
 <td>PR3290-1 g</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> 8-Bromo-2'-deoxyadenosine</td>
 <td>Berry &amp; Associates</td>
 <td>PR3300-1 g</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Sodium iodide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>383112-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Sodium hydrogen carbonate</td>
 <td>Carlo Erba</td>
 <td>478536-500 g </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> 2'-deoxyguanosine:H2O (U-15N5, 96-98%)</td>
 <td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc</td>
 <td>CILNLM-3899-CA-0.1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> 2'-deoxyadenosine (U-15N5, 98%) 95%+ CHEMICAL PURITY</td>
 <td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc</td>
 <td>CILNLM-3895-0.1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Nitrous oxide (N2O) </td>
 <td>Air Liquide </td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Deoxyribonucleic acid from calf thymus</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>D4522-5MG</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60Co-Gammacell</td>
 <td>AECL- Canada </td>
 <td>220</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Immersion well reaction medium pressure 125 watts </td>
 <td>Photochemical reactors ltd</td>
 <td>Model 3010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Evaporating flask 250 ml</td>
 <td>Heidolph</td>
 <td>P/N NS 29/32 514-72000-00</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luna 5 &mu;m C18(2) 100 &Aring;, LC Column 250 x 4.6 mm </td>
 <td>Phenomenex</td>
 <td>00A-4252-E0 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alltima C8 Column 250 x 10 mm 5 &mu;m</td>
 <td>Grace</td>
 <td>88081</td>
 <td>Semipreparative</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SecurityGuard Kit</td>
 <td>Phenomenex</td>
 <td>KJ0-4282</td>
 <td>Analytical holder kit and accessories</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Holder for 10.0 mm ID cartridges</td>
 <td>Phenomenex</td>
 <td>AJ0-7220</td>
 <td>Semipreparative holder </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10.0 mm ID cartridges </td>
 <td>Phenomenex</td>
 <td>AJ0-7221 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-performance liquid chromatography (HPLC) </td>
 <td>Agilent</td>
 <td>1100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LC/MS/MS </td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4000QTRAP System</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tandem mass ESI spectrometer </td>
 <td>(Bruker Daltonics) </td>
 <td>Esquire 3000 plus </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vial 2-4 ml </td>
 <td>SUPELCO </td>
 <td>Cod 27516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vial 4 ml </td>
 <td>SUPELCO </td>
 <td>Cod 27517</td>
 <td></td>
 </tr>
</tbody>
</table>

free radicals in chemical biology: from chemical behavior to biomarker development

Medverkan av fria radikaler i biovetenskap har ständigt ökat med tiden och har anslutits till flera fysiologiska och patologiska processer. Detta ämne omfattar olika vetenskapliga områden, som spänner från fysiska, biologiska och bioorganisk kemi till biologi och medicin, med ansökningar till förbättring av livskvaliteten, hälsa och åldrande. Tvärvetenskapliga färdigheter krävs för fullständig utredning av de många aspekter av radikala processer i den biologiska miljön och kemiska kunskaper spelar en avgörande roll i att avslöja de grundläggande processer och mekanismer. Vi utvecklade en metod kemisk biologi kunna ansluta fria radikaler kemisk reaktivitet med biologiska processer och ger information om de mekanistiska vägar och produkter. Kärnan i denna strategi är utformningen av biomimetiska modeller för att studera biomolekyler beteende (lipider, nukleinsyror och proteiner) i vattenbaserade system, få insikter av reaktionen vägar samt ens bygga upp molekylära bibliotek av de fria radikal-reaktionsprodukterna. Detta sammanhang kan med framgång användas för biomarkörer och exempel är försedda med två klasser av föreningar: mono-transisomerer av kolesterylestrar, vilka syntetiseras och används som referenser för detektion i human plasma, och purin 5 &#39;,8-cyklo-2 &quot;-deoxiribonukleosider, och användes som referens i protokollet för detektion av sådana skador i DNA-prover, efter joniserande strålning eller erhållas från olika hygienkrav.

Isomeriseringen Processen har beskrivits särskilt för kolesterylestrar som ger mono-trans-isomerer av linolsyra och arakidonsyra syror som visas i figur 1 när de första produkterna från detta angrepp, som kan uppstå under förhållanden med fria radikaler stress i den biologiska miljön. 5 I figur 3 den kemiska mekanism som är involverad i cis-trans-dubbelbindning isomerisering visas. Den radikala källan anges i en allmän väg för att ge S-centrerade radikaler. I de beskrivna protokollen radikalen källan är UV-ljus som kan bryta homolitically SH bindningen föreligger i molekylen tiol RSH. Figur 4 sammanfattar de tre stegen protokoll för syntesen av den modifierade lipiden klass och deras detektering i human plasma: syntesen representerar en biomimetisk fri radikal process och ger också en one-pot bekvämt inträde till GEOMETrical isomerer, utan någon förorening av positionsisomerer följt av rening och isolering protokoll. Flera analytiska metoder kan tillämpas för en högkänslig detektering av trans-isomeren innehåll och karakterisering av mono-trans-kolesterylester bibliotek. I synnerhet kan Ramanspektroskopi utföras direkt på kolesterylester fraktionen utan derivatisering (se figur 2 och 9). Det andra exemplet avser purin 5 &#39;,8-cyklo-2&#39;-deoxiribonukleosider, vilka är DNA-lesioner skapats genom angrepp av fria radikaler till positionen C5 &#39;i sockerdelen och efterföljande bildning av en kovalent bindning mellan sockret och basen grupper. Fyra konstruktioner kan framställas, är det, 5 &#39;,8-cyklo-2&#39;-deoxiadenosin och 5 &#39;,8-cyklo-2&#39;-deoxiguanosin, båda existerar i 5&#39;R och 5&#39;S diastereomera former (Figur 5). I figur 6 tonhan reaktionsmekanismen visas, innebär att fotolys av 8-bromopurine derivat 5 att ge motsvarande C8 radikal 6, som intramolekylärt abstraherar en väteatom från C5-positionen selektivt vilket gav 2&#39;-deoxyadenosin-5&#39;-yl-radikal 7. Radical 7 undergår cyklisering med en hastighetskonstant i intervallet 10 5 -10 6 s -1, 2, följt av oxidation av den heteroaromatiska radikalen 8 för att ge de slutliga produkterna 9. Reaktionen av hydroxylradikaler, genereras genom radiolys av vatten, med 2&#39;-deoxiadenosin och 2&#39;-deoxiguanosin (10) befanns inträffa ca. 10% av väte abstraktion från C5 position. 7 Vår kemiska approach för biblioteken av purin 5 &#39;,8-cyklo-2&#39;-deoxiribonukleosider (inklusive märkta föreningar) illustreras i figur 7, med identifieringen av dessa lesioner i oligonukleotider och i DNA-prover erhållna från various källor såsom exempelvis behandlas under joniserande strålning betingelser, som imiterar radikala stressförhållanden. I fig 8 en typisk fotoreaktor utrustningen visas. Anordningen medger bestrålning av föreningar lösta i lämpligt lösningsmedel. Den består av: i) reaktionskammaren utrustad med inlopp för den inerta gasen (på undersidan) och två inlopp för gasutgången och för reagens tillsats, ii) en inre kammare innehållande den lämpliga kvicksilverlampa ansluten till ett kylsystem och elkraft, som är införd i reaktionskammaren genom en glas. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50379/50379fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50379/50379fig1.jpg" /> Figur 1. Mono-transisomerer av kolesteryllinoleat och arakidonat. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;alltid&quot;&gt; <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50379/50379fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50379/50379fig2.jpg" /> Figur 2. Kolesterylestrar i humant serum och direkt analys för mono-transisomerer av Ramanspektroskopi. <img alt="Figur 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50379/50379fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50379/50379fig3.jpg" /> Figur 3. Tillägget-eliminering process som leder till cis-trans isomerisering av dubbelbindningar av thiyl radikaler. <img src="/files/ftp_upload/50379/50379fig4.jpg" alt="Figur 4" /> Figur 4. Tre steg protokoll för utveckling av mono-trans kolesterylestrar som biomarkör av fria radikaler stress. <img alt="Figur 5" fo:content-width="6.5in" fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50379/50379fig5highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50379/50379fig5.jpg&quot; /&gt; Figur 5. De fyra purin 5 &#39;,8-cyklo-2&#39;-deoxiribonukleosid diastereoisomerer. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50379/50379fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se större bild</a> . <img alt="Figur 6" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50379/50379fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50379/50379fig6.jpg" /> Figur 6. Generering av C5-radikaler, antingen genom fotolys av 5 eller genom reaktion av 10 med HO • radikaler och mekanismen för purin 5 &#39;,8-cyklo-2&#39; deoxiribonukleosid bildas. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50379/50379fig6large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se större bild</a> . <img src="/files/ftp_upload/50379/50379fig7.jpg" alt="Figur 7" /> Figur 7. Protokoll feller identifiering av vissa radikala-baserade DNA-skador, mtDNA: mitokondrie-DNA, nDNA: nukleärt DNA. <img src="/files/ftp_upload/50379/50379fig8.jpg" alt="Figur 8" /> Figur 8. Fotokemisk reaktor. <img src="/files/ftp_upload/50379/50379fig9.jpg" alt="Figur 9" /> Figur 9. Representativ Ramanspektrum av plasma kolesterylester. I det infällda jämförelsen av en specifik region med kolesteryllinoleat och kolesteryl-mono-trans linolsyra-isomerer. <img src="/files/ftp_upload/50379/50379fig10.jpg" alt="Figur 10" /> Figur 10. Representativa GC-analys av FAME erhållits från plasma kolesterylestrar. <img alt="Figur 11" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50379/50379fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50379/50379fig11.jpg" /> &lt;strong&gt; Figur 11. Representativa HPLC köra med 2&#39;-deoxyadenosin och 2&#39;-deoxiguanosin tillsammans med sin oxidativa och purin 5 &#39;,8-cyklo-2&#39;-deoxiribo nukleosider. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50379/50379fig11large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se större bild</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Free Radicals in Chemical Biology: from Chemical Behavior to Biomarker Development at JoVE.com

Free Radicals in Chemical Biology: from Chemical Behavior to Biomarker Development

Radical-baserade biomimetisk kemi har tillämpats på uppbyggnad bibliotek som är nödvändiga för biomarkör utveckling.

Fria radikaler i kemisk biologi: från Chemical beteende till biomarkörer utveckling

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Organic Chemistry

Unit 1

Radical Chemistry

Alkene Structure and Reactivity

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Isolering och kemisk karakterisering av lipid A från gramnegativa bakterier

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays

En guidad Materials Screening strategi för utvecklingen av kvantitativa Sol-gel protein från Microarrays

Microarrays have found use in the development of high-throughput assays for new materials and discovery of small-molecule drug leads. Herein we describe a ...

Preparation of Hydrophobic Metal-Organic Frameworks via Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition of Perfluoroalkanes for the Removal of Ammonia

Beredning av hydrofoba metal-organic frame via Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition av perfluoralkaner för borttagning av ammoniak

Plasma enhanced chemical vapor deposition (PECVD) of perfluoroalkanes has long been studied for tuning the wetting properties of surfaces. For high ...

An Inverse Analysis Approach to the Characterization of Chemical Transport in Paints

En Inverse Analys Närma till karakterisering av kemiska Transport i Färger

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in ...

Development of a Backbone Cyclic Peptide Library as Potential Antiparasitic Therapeutics Using Microwave Irradiation

Utveckling av en Backbone cyklisk peptidbibliotek som Potential Antiparasitärt Therapeutics Använda mikrovågsstrålning

Protein-protein interactions (PPIs) are intimately involved in almost all biological processes and are linked to many human diseases. Therefore, there is ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Sekvensering av växt Wall Heteroxylans Använda enzym, Chemical (metylering) och fysiska (masspektrometri, kärnmagnetisk resonans) Tekniker

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

From Molecules to Materials: Engineering New Ionic Liquid Crystals Through Halogen Bonding

Från molekyler till material: iscensätta nya Joniska flytande kristaller genom Halogen Bonding

Herein, we demonstrate that a bottom-up approach, based on halogen bonding (XB), can be successfully applied for the design of a new type of ionic liquid ...