Name: isolation of precursor b-cell subsets from umbilical cord blood
Uploaded: 2013-04-16T13:00:00
Duration: 14 min 6 s
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इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (R00 NCI CA132784) द्वारा समर्थित किया गया के.टी.

<ol>
	<li>Song, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+tissue-specific+differentially+methylated+regions+(TDMs)+with+differential+gene+expression.">Association of tissue-specific differentially methylated regions (TDMs) with differential gene expression.</a> PNAS. 102 (9), 3336-3341 (2005).</li><li>Ohgane, J., Yagi, S., Shiota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics:+The+DNA+methylation+profile+of+tissue-dependent+and+differentially+methylated+regions+in+cells.">Epigenetics: The DNA methylation profile of tissue-dependent and differentially methylated regions in cells.</a> Placenta. 29 (S), 29-35 (2008).</li><li>Brown, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequential+determination+model+of+hematopoiesis.">The sequential determination model of hematopoiesis.</a> Trends Immunol. 28 (10), 442-448 (2007).</li><li>Clark, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+subsets+in+normal+bone+marrow.">Lymphocyte subsets in normal bone marrow.</a> Blood. 67 (6), 1600-1606 (1986).</li><li>Loken, M. 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Immunol. 84 (3), 389-394 (1991).</li><li>Ghia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordering+of+human+bone+marrow+B+lymphocyte+precursors+by+single-cell+polymerase+chain+reaction+analyses+of+the+rearrangement+status+of+the+immunoglobulin+H+and+L+chain+gene+loci.">Ordering of human bone marrow B lymphocyte precursors by single-cell polymerase chain reaction analyses of the rearrangement status of the immunoglobulin H and L chain gene loci.</a> J. Exp. Med. 184, 2217-2219 (1996).</li><li>Noordzij, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+of+precursor+B-cell+compartment+in+bone+marrow+from+patients+with+X-linked+agammaglobulinemia+compared+with+healthy+children.">Composition of precursor B-cell compartment in bone marrow from patients with X-linked agammaglobulinemia compared with healthy children.</a> Pediatric Research. 51 (2), 159-168 (2002).</li><li>van Zelm, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ig+gene+rearrangement+steps+are+initiated+in+early+human+precursor+B+cell+subsets+and+correlate+with+specific+transcription+factor+expression.">Ig gene rearrangement steps are initiated in early human precursor B cell subsets and correlate with specific transcription factor expression.</a> J. Immunol. 175 (9), 5912-5922 (2005).</li><li>Rauch, T. 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लेखक खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

प्रोटोकॉल की सफलता पर सबसे बड़ा प्रभाव के साथ कारक मलबे contaminating की उपस्थिति है. यदि एक गर्भनाल रक्त बैंक से रक्त का अनुरोध यह महत्वपूर्ण है के लिए रक्त के रूप में संग्रह के बाद जितनी जल्दी हो सके भेज दिया. इसके अलावा, नमूने कि lymphocytosis के रूप में वर्गीकृत किया जाता है लिम्फोसाइटों के अधिक संख्या में होते हैं, लेकिन, इन नमूनों बी कोशिकाओं के अग्रदूत की पर्याप्त संख्या नहीं है और नहीं किया जाना चाहिए. कोशिकाओं के अग्रदूत सबसेट हम गर्भनाल रक्त की कम से कम 85 मिलीलीटर के साथ शुरू करने की सलाह देते हैं में से प्रत्येक के लिए पर्याप्त संख्या में प्राप्त करने की संभावना को बढ़ा सकते हैं. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि वयस्क परिधीय रक्त separations के विपरीत, जब गर्भनाल रक्त fractionating mononuclear परत अक्सर लाल रक्त कोशिकाओं के साथ 12 दूषित है. इस प्रोटोकॉल एक अतिरिक्त धोने contaminating प्लेटलेट्स को दूर करने के लिए कदम भी शामिल है. गर्भनाल रक्त से mononuclear separations का वर्णन प्रोटोकॉल एक lysis कदम टी सहित सुझावओ लाल अवांछित कोशिकाओं को हटाने हैं. हम इस कदम की सिफारिश नहीं है क्योंकि यह contaminating मलबे उत्पादन और सेल प्रकार की सफलता पर एक नकारात्मक प्रभाव पड़ता है. आदेश में कोशिकाओं है कि प्रवाह cytometry से प्रतिष्ठित किया है की संख्या को कम करने के लिए यह जरूरी है कि एक बी कोशिका संवर्धन सेल छँटाई करने से पहले प्रदर्शन. Miltenyi बायोटेक, कि बी - सेल अलगाव किट (बी CLL) के साथ प्रदान की प्रोटोकॉल परिधीय रक्त के लिए अनुकूलित किया गया है और 10 μl 10 मिलियन कोशिकाओं प्रति बी CLL बायोटिन एंटीबॉडी कॉकटेल इस्तेमाल की सिफारिश की है. CD4 (टी कोशिकाओं) CD11b (granulocytes, monocytes, मैक्रोफेज), CD16 (एन.के. कोशिकाओं, मैक्रोफेज, मस्तूल कोशिकाओं), CD36 (प्लेटलेट्स), CD235a (erythroid सेल), यह कदम (एन.के. कोशिकाओं टी कोशिकाओं) CD2 के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करता है गर्भनाल रक्त से गैर - बी कोशिकाओं खलाना. यह वर्णित किट और बी सेल अलगाव नहीं किट द्वितीय का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि पूर्व किट CD43 जो समर्थक बी कोशिकाओं पर मौजूद है के खिलाफ एक एंटीबॉडी शामिल हैं. हमारे सेशन के दौरानइस प्रोटोकॉल के timization, हमने पाया है कि बी CLL बायोटिन एंटीबॉडी कॉकटेल के 40 μl के एक कुल के लिए एक सकारात्मक सेल सॉर्ट परिणाम का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त है. इसके अलावा हम पाया कि बी CLL बायोटिन एंटीबॉडी कॉकटेल के रूप में छोटे रूप में 5 μl अधिक का उपयोग करने के लिए सेल प्रकार पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ा. इसलिए, हम अत्यधिक बी CLL बायोटिन एंटीबॉडी कॉकटेल के 40 μl कुल 175-250000000 के बीच mononuclear सेल नंबर के लिए उपयोग करने की अनुशंसा. यदि कोशिकाओं की संख्या कम या अधिक के साथ शुरू करने के लिए यह आवश्यक हो अभिकर्मकों तदनुसार पैमाने पर हो सकता है. वहाँ कई परस्पर विरोधी मार्करों कि बी कोशिकाओं के उप आबादी भेद किया जा सकता का वर्णन प्रकाशनों हैं. विसंगति की अधिकांश तथ्य यह है कि भेदभाव एक प्रक्रिया पर जा रहा है और या कोशिका की सतह मार्करों की उपस्थिति या अनुपस्थिति के बजाय एक सब कुछ या कुछ तरीके में क्रमिक ढंग से होता है कि द्वारा समझाया जा सकता है. / CD19 + और ​​+ CD45 की तीव्रता के स्तर (- इस प्रोटोकॉल CD34निम्न, मध्यम, उच्च) अभिव्यक्ति CD45 6 भेदभाव की प्रगति के लिए इसी अभिव्यक्ति के स्तर में वृद्धि के साथ पूर्व द्विपक्षीय, पूर्व BII और अपरिपक्व बी कोशिकाओं भेद करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. प्रो बी कोशिकाओं में कुछ लोगों द्वारा वर्णित किया गया है CD19 हो / CD34 + 13 + जबकि दूसरों को पता चला है कि समर्थक बी कोशिकाओं CD19 - / CD34 और पूर्व द्विपक्षीय कोशिकाओं CD19 / CD34 + 9,10 + +. इन विसंगतियों के आधार पर हम देर समर्थक बी कोशिकाओं / जल्दी पूर्व बीआई कोशिकाओं के रूप में CD19 + / CD34 + कोशिकाओं में नामित किया है. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि इस रणनीति बी कोशिकाओं है कि रोग तीव्र लिम्फोब्लासटिक ल्यूकेमिया से प्रभावित कोशिकाओं के अनुरूप अग्रदूत के सबसेट को अलग करने के लिए विकसित किया गया था. हालांकि, वहाँ कई छँटाई रणनीतियों कि ब्याज की सेल subtype पर निर्भर करता है नियोजित किया जा सकता हैं. एंटीबॉडी fluorochrome संयोजन उपलब्ध सेल सॉर्टर की क्षमताओं के आधार पर चुना जाना चाहिए. एक generaएल नियम, अपने पैनल में प्रतिभाशाली fluorochrome कम से कम अधिक आबादी वाला प्रतिजन और ठीक इसके विपरीत लेबल करने के लिए किया जाना चाहिए. डबल दाग आबादी, विशेष रूप से इस तरह के रूप में इन दुर्लभ घटनाओं का पता लगाने, नक़ल भेदभाव (चित्रा 2B) gating की रणनीति का एक vitally महत्वपूर्ण हिस्सा है. यह सुनिश्चित करता है कि डबल सकारात्मक घटनाओं वास्तव में एकल दोनों एंटीबॉडी और दो नहीं केवल एकल दाग कोशिकाओं को एक दूसरे के पालन के साथ दाग कोशिकाओं रहे हैं. उच्च गति, 4 तरह सेल छँटाई जरूरी एक नियंत्रित एयरोसोल वातावरण बनाता है. इसलिए, जीना मानव सेल छँटाई महान देखभाल के साथ किया जाना चाहिए. प्रकाशित सुरक्षा और परिशोधन दिशानिर्देश उपलब्ध हैं और समीक्षा की जानी चाहिए और 14 तरह से पहले लागू किया है. संस्थागत जैवसुरक्षा समितियों या उनके समकक्ष से स्वीकृति छंटाई करने के लिए पहले की आवश्यकता हो सकती है. छंटाई के बाद उचित परिशोधन के लिए, ब्लीच अपशिष्ट कंटेनर के लिए 10% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ा जाना चाहिए. सीmilarly, सभी नमूनों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ट्यूबिंग तत्काल क्षेत्र में सभी सतहों को अच्छी तरह से एक नया बना 10% ब्लीच समाधान के साथ decontaminated किया जाना चाहिए. सारांश में, इस प्रोटोकॉल बी कोशिकाओं के अग्रदूत के दुर्लभ आबादी को प्राप्त करने के लिए एक रणनीति प्रदान करता है और किसी भी दुर्लभ hematopoietic स्टेम कोशिकाओं और टी कोशिकाओं अपरिपक्व सहित कॉर्ड रक्त में मौजूद आबादी को अलग करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. हाल ही में, अपरिपक्व बी कोशिकाओं परिधीय रक्त में उन्नत एचआईवी के साथ 15 व्यक्तियों की पहचान की गई है. इसलिए, इस पद्धति की उपयोगिता रक्त कैंसर के अध्ययन से परे फैली हुई है. अंत में, हम अभी तक प्रवाह क्रमबद्ध कोशिकाओं पर आरएनए isolations प्रदर्शन किया है, हालांकि, इस पद्धति चेतावनी के साथ अनुकूलनीय है कि सेल के दौरान छँटाई कोशिकाओं trizol या RLT के रूप में इस तरह के एक बराबर आरएनए संगत समाधान में सीधे चाहिए RNeasy किट से हल करना चाहिए Qiagen के माध्यम से उपलब्ध है.

आदेश में aberrations है कि इस बीमारी में मौजूद हैं की पहचान करने के लिए, यह vitally महत्वपूर्ण है कि हम स्वस्थ ऊतकों या कोशिकाओं है कि रोग से प्रभावित ऊतक या सेल प्रकार के अनुरूप का उपयोग करें. इसका एक कारण यह है कि ऊतक प्रकार के बीच epigenetic परिवर्तन जीन की अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए जिम्मेदार है और सामान्य मानव विकास 1,2 के दौरान सेलुलर भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण है कि. एक दूसरा कारण यह है कि न्यायपालिका ऊतक विशिष्ट जीन विनियमन सामान्य विकास पर गंभीर परिणाम हो और कैंसर सहित रोग राज्यों की एक भीड़ के लिए योगदान के लिए जाना जाता है. इसलिए, एक रोग है कि hematopoietic कोशिकाओं शामिल है की एक बेहतर समझ स्वस्थ hematopoietic कोशिकाओं के ज्ञान की आवश्यकता है. कोशिका की सतह की अभिव्यक्ति में परिवर्तन की विशेषता घटनाओं की एक व्यवस्थित क्रम के माध्यम से अस्थि मज्जा आय में hematopoietic कोशिकाओं के विकास 3 मार्करों. वयस्क प्रतिभागियों को शामिल अध्ययनपता चला है कि आमतौर पर अस्थि मज्जा बी कोशिकाओं 4,5 अग्रदूत के कम संख्या में शामिल है, जबकि बाल चिकित्सा प्रतिभागियों को शामिल अध्ययन से पता चला है कि बी कोशिकाओं के अग्रदूत के प्रतिशत 6 साल की उम्र के कम से कम 5 साल के व्यक्तियों में अपेक्षाकृत अधिक है. गर्भनाल रक्त रक्त संबंधी विकारों दुर्दमताओं के उपचार में hematopoietic स्टेम कोशिकाओं के एक स्रोत के रूप में प्रयोग किया जाता है, गर्भनाल रक्त बैंकों के माध्यम से आसानी से उपलब्ध है और अपरिपक्व बी और टी कोशिकाओं 7 जो ल्यूकेमिया सहित कई विकारों के लक्ष्य कोशिकाओं के लिए समृद्ध है lymphomas. अस्थि मज्जा में बी कोशिकाओं अग्रदूत बड़े पैमाने पर किया गया है 8,9 phenotyped और अलग कैंपेन्स इन कोशिकाओं को हल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है विशिष्ट कोशिका की सतह मार्करों की उपस्थिति से परिभाषित किया जा सकता है. सामान्य बी सेल अस्थि मज्जा में जल्द से जल्द समर्थक बी कोशिकाओं के साथ शुरुआत और अपरिपक्व या भोले बी कोशिकाओं में culminating चरणों की एक श्रृंखला के माध्यम से भेदभाव आय. अनुसारवैन Zelm और उनके सहयोगियों ने 10, समर्थक बी कोशिकाओं CD34 की उपस्थिति से और 2 चरण के लिए संक्रमण (पूर्व बीआई) CD19 अधिग्रहण कर लिया है की विशेषता है. स्टेज 3 (पूर्व BII) कोशिकाओं अब CD34 व्यक्त है और cytoplasmic आईजीएम व्यक्त शुरू. अंत में, 4 चरण के एक परिभाषित विशेषता (अपरिपक्व कोशिकाओं बी) सतह आईजीएम की अभिव्यक्ति है. इस प्रोटोकॉल में वर्णित रणनीति छँटाई 1 Caldwell और उनके सहयोगियों ने 6 द्वारा वर्णित किया गया था और केवल 3 कोशिका की सतह मार्करों जो बहुत जटिलता और सेल छँटाई प्रयोगों प्रदर्शन की लागत कम कर देता का उपयोग भी शामिल है. उनके काम में, CD45 के बीच एक रिश्ता और बी सेल भेदभाव के चरणों में स्थापित किया गया था. उन्होंने कहा कि अस्थि मज्जा में बी कोशिकाओं CD45 की अभिव्यक्ति के चर स्तर पर प्रदर्शित. विशेष रूप से, कोशिकाओं है कि CD45 के उच्च स्तर पर व्यक्त कोशिकाओं है कि सतह आईजीएम (अपरिपक्व कोशिकाओं बी) के लिए corresponded, जो है कि CD45 के एक मध्यवर्ती स्तर व्यक्त कोशिकाओं कि cytopl व्यक्त करने के लिए correspondedasmic (पूर्व - BII कोशिकाओं) आईजीएम, और उन है कि CD45 के निम्न स्तर व्यक्त कोशिकाओं है कि cytoplasmic आईजीएम व्यक्त नहीं कोशिकाओं (पूर्व बीआई) के लिए corresponded. इस प्रोटोकॉल Caldwell और उनके सहयोगियों ने 6 से विकसित करने के लिए गर्भनाल रक्त (1 चित्रा) से बी कोशिकाओं जो बहाव के द्वीप methylated CPG वसूली परख जैसे उच्च गुणवत्ता nucleic एसिड की आवश्यकता assays में इस्तेमाल किया जा सकता है (मीरा अग्रदूत के सबसेट अलग रणनीति का उपयोग करता है 11) और मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर assays. विधि एक प्रारंभिक जुदाई चुंबकीय मोतियों का उपयोग करने के लिए गर्भनाल रक्त से सभी गैर - बी कोशिकाओं व्यय को रोजगार और केवल 3 एंटीबॉडी (CD34, CD19 और CD45) के साथ धुंधला की आवश्यकता है. कोशिकाओं है कि बरामद कर रहे हैं बी सेल भेदभाव के 4 चरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं: 1 CD34) + CD19 (देर समर्थक बी और पूर्व द्विपक्षीय जल्दी), 2) CD34, CD19 +, कम CD45 (देर से पूर्व बीआई); ) 3 CD34 -; CD19 +; CD45 मेड (पूर्व BII), और 4) CD34 -; सीD19 +; CD45 उच्च (अपरिपक्व कोशिकाओं बी).

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Column</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Multi Stand</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-Cell Isolation Kit (B CLL)</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-660</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATLANTA Biologicals</td>
			<td>S11195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.5 ml)</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>SS1500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559763</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555415</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD34</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560941</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347463</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock Solution</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352058</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 50 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352098</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PuraFlow Sheath Fluid, 8X</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CY30230</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowCheck Alignment beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6605359</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Rainbow Alignment beads</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>URFP-30-2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViroSafe Aerosol Evacuation Filter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>ML01330</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC Mouse bead kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10344</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &mu;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Scientific Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>accuSpin Model 3R Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-516</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>ML99030</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Evacuation Unit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of precursor b-cell subsets from umbilical cord blood

गर्भनाल रक्त अत्यधिक अलग वंश प्रतिबद्धता चरणों में hematopoietic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के लिए समृद्ध है. हम भेदभाव के चार अलग - अलग चरणों में बी कोशिकाओं अग्रदूत अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है. क्योंकि जीनों व्यक्त कर रहे हैं और epigenetic संशोधनों एक ऊतक विशिष्ट तरीके होते हैं, यह महत्वपूर्ण है के लिए ऊतकों और सेल प्रकार के बीच भेदभाव के क्रम में जीनोम और epigenome है कि इस रोग के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते में परिवर्तन की पहचान करने में सक्षम हो. इस विधि सेल गर्भनाल रक्त में भेदभाव के किसी भी स्तर पर वर्तमान के किसी भी प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इस विधि में 4 मुख्य कदम शामिल हैं. पहले, mononuclear कोशिकाओं घनत्व centrifugation से अलग हो रहे हैं. दूसरा, बी कोशिकाओं बायोटिन संयुग्मित एंटीबॉडी कि पहचान और गैर mononuclear कोशिकाओं से बी कोशिकाओं को हटाने का उपयोग कर समृद्ध कर रहे हैं. थर्ड बी कोशिकाओं fluorescently कोशिका की सतह प्रोटीन को अलग - अलग चरणों के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ लेबल रहे हैंबी सेल के विकास के. अंत में, fluorescently लेबल कोशिकाओं को हल कर रहे हैं और व्यक्ति आबादी बरामद कर रहे हैं. बरामद की कोशिकाओं को पर्याप्त मात्रा और गुणवत्ता के अनुप्रवाह न्यूक्लिक एसिड assays में उपयोग किया जा रहे हैं.

नमूने के बीच भिन्नता सेल तरह (1 टेबल) की सफलता में एक भूमिका निभाता है. अच्छी सफलता दर के साथ नमूने contaminating मलबे के निम्न स्तर (चित्रा 3) है और गरीब सफलता दर के साथ नमूने contaminating मलबे के उच्च स्तर (3B चित्रा). नमूने के बीच भिन्नता कुछ हद तक जा सकता है अगर गर्भनाल रक्त नमूना लदान (/ ओ एन पहली प्राथमिकता) के 24 घंटे के भीतर एकत्र किया गया था नियंत्रित किया जा सकता है. प्रत्येक अग्रदूत सबसेट बी सेल से प्रवाह क्रमबद्ध कोशिकाओं को पर्याप्त मात्रा में और लिए न्यूक्लिक एसिड isolations प्रदर्शन गुणवत्ता के हैं. पृथक डीएनए उच्च गुणवत्ता की है और बहाव के विश्लेषण में इस्तेमाल किया जा सकता है. हम नियमित रूप से 11 मीरा में यह डीएनए का उपयोग करने के लिए डीएनए methylated (4 चित्रा) के लिए समृद्ध है. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> गर्भनाल रक्त सुविधा डेटा </td><td> गरीब क्रमबद्ध करें </td><td><strong&gt; अच्छा क्रमबद्ध करें </td></tr><tr><td> कार्य anticoagulant के साथ रक्त की मात्रा (एमएल) </td><td> 110 </td><td> 104 </td></tr><tr><td> सफेद रक्त कोशिकाओं [10 3 μl /] </td><td> 8.68 </td><td> 11.19 </td></tr><tr><td> लिम्फोसाइटों [10 3 μl /] </td><td> 3.88 </td><td> 3.76 </td></tr><tr><td> लिम्फोसाइट (%) </td><td> 44.70 </td><td> 33.6 </td></tr><tr><td> लाल रक्त कोशिकाओं [10 6 μl /] </td><td> 3.65 </td><td> 3.05 </td></tr><tr><td colspan="3"> घर में डेटा </td></tr><tr><td> Ficoll Paque के बाद सेल नंबर </td><td> 206 एम </td><td> 309 एम </td></tr><tr><td> एमएसीएस पृथक्करण के बाद सेल नंबर </td><td> 22 एम </td><td> 16.5 मीटर </td></tr><tr><td> कुल घटनाक्रम काउंट (MoFlo XDP) </td><td> 30.57 एम </td><td> 19.97 एम </td></tr><tr><td> व्यवहार्यता (%) </td><td> 98.00 </td><td> 98.00 </td></tr><tr><td> लिम्फोसाइट गेट में कक्ष (%) </td&gt; <td> 17.00 </td><td> 50.00 </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 / CD34 + + </td></tr><tr><td> कुल सेल नंबर </td><td> 10959 </td><td> 48316 </td></tr><tr><td> कुल ईवेंट का% </td><td> 0.04 </td><td> 0.24 </td></tr><tr><td> दक्षता </td><td> 88% </td><td> 88% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - कम / CD45 </td></tr><tr><td> कुल सेल नंबर </td><td> 16619 </td><td> 26941 </td></tr><tr><td> कुल ईवेंट का% </td><td> 0.05 </td><td> 0.13 </td></tr><tr><td> दक्षता </td><td> 89% </td><td> 87% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / CD45 मेड </td></tr><tr><td> कुल सेल नंबर </td><td> 469745 </td><td> 507540 </td></tr><tr><td> कुल ईवेंट का% </td><td> 1.54 </td><td> 2.54 </td></tr><tr><td> दक्षता </td><td> 89% </td><td> 89% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / उच्च CD45 </td></tr><tr><td> कुल सेल नंबर </td><td> 1896062 </td><td> 2047142 </td></tr><tr><td> कुल ईवेंट का% </td><td> 6.2 </td><td> 10.25 </td></tr><tr><td> दक्षता </td><td> 91% </td><td> 90% </td></tr></tbody></table> तालिका 1. प्रतिनिधि सेल तरह आँकड़े पंक्तियाँ 1-5 गर्भनाल रक्त सुविधा प्रदान मायने रखता हैं. शेष पंक्तियाँ हमारी प्रयोगशाला में एकत्र आंकड़ों हैं. गरीब तरह मलबे के उच्च स्तर और लिम्फोसाइट फाटक में एक कोशिकाओं के कम प्रतिशत निहित. <img alt="चित्रा 1" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig1.jpg" /> Figu1 रहे हैं. प्रक्रिया का प्रवाह चार्ट गर्भनाल रक्त और संसाधित mononuclear कोशिकाओं Ficoll paque प्लस का उपयोग कर से अलग कर रहे हैं. एक अतिरिक्त कदम धोने contaminating प्लेटलेट्स को दूर करने के लिए शामिल है. बी कोशिकाओं mononuclear एमएसीएस मानव अलगाव बी सेल किट (बी CLL) कोशिकाओं का उपयोग कर से अलग कर रहे हैं. बायोटिन - संयुग्मित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी इस कदम (CD2, CD4, CD11b, CD36, विरोधी IgE और CD235a) का उपयोग करता है के लिए सभी गैर - बी कोशिकाओं को दूर कर सकते हैं. बरामद बी कोशिकाओं CD19-APC, CD34 पीई और CD45-FITC एंटीबॉडी तो MoFlo XDP प्रवाह अग्रदूत बी सेल सबसेट ठीक cytometer का उपयोग कर हल के साथ चिह्नित कर रहे हैं: CD19 + / CD34 + CD19 + / CD34 - / CD45 कम ; CD19 + / CD34 / CD45 मेड, और CD19 + / CD34 - / उच्च CD45. <img alt="चित्रा 2" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig2.jpg" /> चित्रा 2. पॉप के लिए पहचान करने और छँटाई Gating रणनीतिulations लाल तीर गेट से संकेत मिलता है कि बाद में भूखंड के लिए लागू किया जाता है. R4, R5, R6 और R7 फाटकों क्रमबद्ध आबादी से संकेत मिलता है) आगे बनाम ओर तितर बितर समृद्ध लिम्फोसाइट आबादी दिखा साजिश. R1, लिम्फोसाइट फाटक ख) लंबाई बनाम एकल कक्षों बनाम दोहरी की पहचान करने के लिए आगे तितर बितर साजिश की चौड़ाई. R2, एकल कोशिका फाटक ग) CD19 APC सकारात्मक कोशिकाओं CD34 पीई नकारात्मक और सकारात्मक आबादी में गिर जाते हैं. R3, CD19 + / CD34 - गेट, R4, CD19 / CD34 + + फाटक का संकेत वांछित तरह जनसंख्या घ CD19) / + CD34 कोशिकाओं तीन कुछ अलग CD45 FITC आबादी में गिर जाते हैं. R5 और R6, + / CD34 CD19 / CD45 कम और CD19 + / CD34 - / CD45 मेड आबादी, क्रमशः. R7, + / CD19 CD34 में उच्च सेल नंबर की वजह से / CD45 उच्च जनसंख्या, इस तरह केवल गेट शामिलआबादी का एक भाग है. इस आबादी की सभी कोशिकाओं को बहाव के विश्लेषण के लिए एकत्र होने की जरूरत नहीं है. <img alt="चित्रा 3" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig3.jpg" /> चित्रा 3.) स्तंभ संवर्धन के बाद मलबे contaminating के निम्न स्तर. R1, लिम्फोसाइट फाटक). ख स्तंभ संवर्धन के बाद मलबे contaminating के उच्च स्तर है. <img alt="चित्रा 4" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig4.jpg" /> 4 के बाहर चित्रा. डीएनए methylated के संवर्धन. बी कोशिकाओं के अग्रदूत के सबसेट से एक) sonicated अग्रदूत बी सेल सबसेट से अलग डीएनए उच्च गुणवत्ता की है. पुस्तकालय निर्माण डीएनए के लिए 200-600 बीपी के एक औसत sonicated है. लेन 1: 100 बीपी PROMEGA कैटलॉग (# G2101) सीढ़ी, 2 लेन: कुल पृथक डीएनए CD19 से + / CD34 + कोशिकाओं, 3 लेन: कुल CD19 से पृथक डीएनए + </sऊपर /&gt; CD34 / CD45 कम कोशिकाओं, 4 लेन: 100 एनजी डीएनए CD19 + / CD34 से अलग - / CD45 मेड कोशिकाओं, 5 लेन: 100 एनजी CD19 + / CD34 से अलग डीएनए / CD45 उच्च कोशिकाओं. डीएनए 9 मिनट (, 30 सेकंड से 30 सेकंड) के एक कुल के लिए उच्च पर Diagenode Bioruptor का उपयोग sonicated किया गया था. डीएनए स्तंभ शुद्ध था और SYBR हरी न्यूक्लिक एसिड जेल दाग के साथ एक 1% agarose जेल पर visualized ख. मीरा ActivMotif MethylCollector अल्ट्रा किट, SLC25A37 साथ पीसीआर (1-6) और APC1 (7-12) का उपयोग करने के बाद) पुष्टि करने के लिए किया जाता है डीएनए methylated के संवर्धन. 1 और 7: (कोई मीरा) sonicated जीनोमिक डीएनए, 2 और 8: मीरा - CD19 + / CD34 डीएनए +, 3 और 9: मीरा - CD19 / CD34 + - CD45 / कम डीएनए, 4 और 10: मीरा - CD19 / + CD34 - / CD45 मेड डीएनए, 5 और 11: मीरा CD19 / + CD34 - / CD45 उच्च डीएनए, 6 और 12: जल नियंत्रण. SLC25A37 की उच्च प्रवर्धन डीएनए methylated के संवर्धन की पुष्टिबी कोशिकाओं के अग्रदूत के सबसेट में.

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Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

यहाँ हम गर्भनाल रक्त से अग्रदूत के सबसेट बी कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. पर्याप्त और न्यूक्लिक एसिड की मात्रा और गुणवत्ता कोशिकाओं से निकाला जा सकता है और बाद डीएनए या शाही सेना का उपयोग assays में इस्तेमाल किया.

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