Name: biochemical titration of glycogen in vitro
Uploaded: 2013-11-24T19:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biochemical Titration of Glycogen In vitro at JoVE.com

نحن ممتنون إلى الدكتور تييري Pourcher على إتاحة الفرصة لنا لاستخدام مطياف مضان ومساعدته. ويتم تمويل المختبر من قبل الدوري الفرنسي الوطني كونتر جنيه السرطان (فريق الرياضي labellisée)، وجمعية بحوث صب لا مناهضة جنيه السرطان، والمعهد الوطني للسرطان (إنكا)، والوكالة الوطنية صب لا بحوث، METOXIA (برنامج الاتحاد الأوروبي FP7)، والمركز A. Lacassagne، والمركز الوطني للبحوث العلميه، والمعهد الوطني للسانتيه آخرون دي لا بحوث ميديكال وجامعة نيس ( <a href="http://www.unice.fr/isdbc/" target="_blank">http://www.unice.fr/isdbc/</a> ). نشكر الدكتور كريستيان M الإبراهيمي في القرن لقراءة نقدية وتصحيح التحرير.

المعايرة الكيميائية الحيوية من الجليكوجين 1. تحلل الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا البذور بتركيز 0.5-2 × 10 6 لكل 100 ملم طبق القطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العلاج: احتضان خلايا 24، 48، أو 72 ساعة في تر...

<ol>
	<li>Pelletier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+Synthesis+is+Induced+in+Hypoxia+by+the+Hypoxia-Inducible+Factor+and+Promotes+Cancer+Cell+Survival.">Glycogen Synthesis is Induced in Hypoxia by the Hypoxia-Inducible Factor and Promotes Cancer Cell Survival.</a> Front Oncol. 2, (2012).</li><li>Alonso, M. D., Lomako, J., Lomako, W. M., Whelan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+look+at+the+biogenesis+of+glycogen.">A new look at the biogenesis of glycogen.</a> FASEB J. 9, 1126-1137 (1995).</li><li>Bollen, M., Keppens, S., Stalmans, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+features+of+glycogen+metabolism+in+the+liver.">Specific features of glycogen metabolism in the liver.</a> Biochem. J. 336 (Pt 1), 19-31 (1998).</li><li>Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMP-activated+protein+kinase+does+not+associate+with+glycogen+alpha-particles+from+rat+liver.">AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 362, 811-815 (2007).</li><li>Sullivan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+of+alpha+and+beta+particles+in+glycogen+using+molecular+size+distributions.">Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions.</a> Biomacromolecules. 11, 1094-1100 (2010).</li><li>Chee, N. P., Geddes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+liver+glycogen.">The structure of liver glycogen.</a> FEBS Lett. 73, 164-166 (1977).</li><li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+and+its+metabolism:+some+new+developments+and+old+themes.">Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes.</a> Biochem. J. 441, 763-787 (2012).</li><li>Moses, S. W., Bashan, N., Gutman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+metabolism+in+the+normal+red+blood+cell.">Glycogen metabolism in the normal red blood cell.</a> Blood. 40, 836-843 (1972).</li><li>Agbanyo, M., Taylor, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+3-deoxy-3-fluoro-D-glucose+into+glycogen+and+trehalose+in+fat+body+and+flight+muscle+in+Locusta+migratoria.">Incorporation of 3-deoxy-3-fluoro-D-glucose into glycogen and trehalose in fat body and flight muscle in Locusta migratoria.</a> Biosci. Rep. 6, 309-316 (1986).</li><li>Louzao, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Fluorescent+glycogen"+formation+with+sensibility+for+in+vivo+and+in+vitro+detection.">"Fluorescent glycogen" formation with sensibility for in vivo and in vitro detection.</a> Glycoconj. J. 25, 503-510 (2008).</li><li>Sheehan, D. C. H., B, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histotechnology. , (1980).</li><li>Baba, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibody+that+recognizes+glycogen+and+its+application+for+immunohistochemistry.">Production of monoclonal antibody that recognizes glycogen and its application for immunohistochemistry.</a> Kokubyo Gakkai Zasshi. 60, 264-287 (1993).</li></ol>

المعايرة الكيميائية الحيوية من الجليكوجين في المختبر يسمح الكمي الدقيق للخلايا محتوى الجليكوجين. مقارنة مع بعض التقنيات الأخرى (PAS، المناعي مع الأجسام المضادة الجليكوجين، الخ)، وهذه المعايرة هي محددة جدا وحساسة وقابلة للتكرار. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطر...

الجليكوجين هو بوليمر multibranched من بقايا الجلوكوز، والتي هي موجودة في السيتوبلازم العديد من أنواع الخلايا. وهي واحدة من أهم أشكال تخزين الطاقة في الخلايا ويلعب دورا هاما في أيض الجلوكوز. معظم خلايا الثدييات هي قادرة على انتاج وتخزين الجليكوجين، والتي يمكن أن يتحلل سريعا إلى جلوكوز لتعزيز إنتاج وتحلل ATP أثناء الإجهاد الأيضي. خلايا الكبد تنتج كميات هائلة من الجليكوجين لتنظيم مستوى السكر في الدم وبالتالي توفير امدادات مستمرة من الجلوكوز في الجسم. في المقابل، فإن تركيز الجليكوجين في خلايا أخرى (العضلات، وخلايا الدم الحمراء، الخ) منخفضة نسبيا. ومع ذلك، محليا، وهذه الكميات كافية لتوفير الطاقة على المدى القصير عند فجأة تتعرض الخلايا لبيئة المحرومين من المواد المغذية. توليف الجليكوجين والجليكوجين انهيار يتبع نفس الخطوات في جميع الأنسجة (الشكل 1). أولا، الجلوكوزيدخل الخلايا عن طريق ناقلات الجلوكوز (افراط)، ويتم تحويلها بسرعة من الجلوكوز 6 فوسفات (G6P) إلى جلوكوز-1-الفوسفات (G1P) من خلال فسفوغلوكوموتاز. ثم يتم تعديل G1P الى UDP الجلوكوز، ويتم إرفاق C1 الكربون من UDP الجلوكوز إلى بقايا التيروزين من glycogenin، البروتين رسو الجليكوجين. هذا الجزيء، يعتبر التمهيدي الجليكوجين، تم تمديده عن طريق الحجز من UDP الجلوكوز إلى جلوكوز عن طريق محطة α (1 → 4) السندات عن طريق سينسيز الجليكوجين. أخيرا، عندما يتم تشكيل سلسلة خطية من أكثر من 11 بقايا الجلوكوز، انزيم المتفرعة نقل وقليل السكاريد محطة مكونة من ما لا يقل عن 6 إلى بقايا الجلوكوز الجلوكوز آخر من سلسلة المجاورة من خلال α (1 → 6) الربط. تكرار هذه العملية يعطي هيكل كسورية ضخمة تحتوي على الفروع التي تشكل الحلزون مع 6.5 الجلوكوز في المقابل. الجليكوجين يمكن أن يكون باتجاهين معاكسين تحلل إلى جلوكوز عن طريق العمل المتضافرمن المشذب الانزيمات التي يتحلل لα (1 → 6) ملزمة والجليكوجين فسفوريلاز أن hydrolyzes وα (1 → 4) غليكوزيدية المربوطة بين بقايا الماضي من الجلوكوز من فرع وجزيء الجليكوجين. يتم تنشيط هذا التفاعل يسمى تحلل الغليكوجين من خلال زيادة مستويات AMP (التي تعكس استهلاك ATP)، وتحول دون الجلوكوز وATP 2،3. بواسطة المجهر الإلكتروني، وقد وصفت جزيئات الجليكوجين في العديد من أنواع الخلايا جزيئات β كما حرة (أو monoparticles الجليكوجين) من 15-30 نانومتر في القطر. في أنواع معينة من الخلايا مثل خلايا الكبد، والجسيمات β يمكن تجميعها في مجمع لتشكيل ريدات، والمعروف أيضا باسم جسيمات α التي تختلف في القطر من 80 نانومتر إلى حد أقصى قدره 200 نانومتر 4 </سوب&gt;. الطريق مستعبدين هذه الجسيمات β لتشكيل مجموعات أكبر من الجسيمات α لا يزال غير توضيح بالكامل. يميل بعض الأدلة لإثبات أن الجزيئات β يمكن المستعبدين من قبل الرابطة التساهمية 5، الرابطة الهيدروجينية، أو حتى من خلال تفاعلات البروتين البروتين 6. كمية الجليكوجين المخزن في الخلايا يعتمد على الكثير من العوامل: (I) كمية glycogenin في الخلية التي يبدأ تخليق الجليكوجين، (الثاني) نشاط سينسيز الجليكوجين وفسفوريلاز ينظمها البروتين الفسفرة / نزع الفسفات، (الثالث) تركيز الجلوكوز في الخلايا، والتي تعتمد على عدة معايير مثل توريد الجلوكوز من الأوعية الدموية وامتصاص الجلوكوز من قبل الخلايا. وينظم مخازن الجليكوجين بإحكام من قبل تنظيم تفارغي الهرمونات السكروز من خلال نواتج وسيطة، من خلال الهرمونات التي تنظم عملية التمثيل الغذائي والطاقة، والمواد الغذائية الاستشعار عن مسارات إشارات 7. من المهم أن تكونقادرة على تحديد الجليكوجين في العينات البيولوجية إلى فهم أفضل لأهمية التمثيل الغذائي الجليكوجين في الجسم كله والمستوى الخلوي. نحن هنا وصف دقيق البيوكيميائية، واستنساخه ومريحة في فحص المختبر لالجليكوجين. ويستند هذا الأسلوب على مضان الجلوكوز الكمي قبل وبعد التحلل محددة من الجليكوجين. توجد طرق أخرى لتقدير مستوى الجليكوجين في الخلايا، ولكن معظمهم ليسوا الكمي. واستند واحدة من التقنيات أول وصف لتقدير حجم الجليكوجين في الخلايا على قياس التأسيس [14 C] الجلوكوز في الجليكوجين 8،9. استخدام النشاط الإشعاعي يجعل هذه العملية أكثر صعوبة في التعامل معها ولكن له ميزة توفير نسبة الجلوكوز إلى الجليكوجين التأسيس والتمييز بين توزيع بقايا الجلوكوز على الفروع والخارجي في قلب جزيء (فإنه يتطلب أيضا β-amyloly إضافيةجهاز الأمن والمخابرات وخطوة الكروماتوغرافي). وقد تم تطوير تقنية أخرى في الآونة الأخيرة ويقوم على دمج 2-NBDG (2 - {N-[7 nitrobenz-2-oxa-1 ،3-diazol-4-YL]} الأمينية-2-deoxyglucose)، و 2-deoxyglucose مشتقة الفلورسنت، في الجليكوجين 10. قياس كثافة مضان يعكس كمية الجليكوجين إنتاجها ويمكن قياس مع قارئ مضان. ويمكن أيضا توزيع مضان في الخلية يتم تقييمها بواسطة المجهر متحد البؤر. من بين التقنيات الأخرى nonquantitative، الدوري حمض شيف تلطيخ (PAS) وربما كان الأكثر شيوعا. ويمكن استخدامه للكشف عن الجليكوجين في خلايا ثابتة، أقسام الأنسجة في البارافين أو المجمدة. هذه الألوان تقنية النسيجية تحديدا غير السكريات، السكرية، البروتينات السكرية، والسليلوز mucins محايد باللون الأرجواني. ويمكن زيادة خصوصية هذا الاختبار عن طريق العلاج من خلايا ثابتة أو أقسام الأنسجة مع دياستاز، الذي يساعد على هضم تحديدا الجليكوجين. بعد ذلك،مستوى الجليكوجين يمكن تقدير نوعيا من خلال مقارنة عينات unhydrolyzed (جميع الجزيئات الكربوهيدرات تعديل) لعينات تحلل (الكربوهيدرات تعديل الجزيئات باستثناء الجليكوجين). يوفر تلطيخ PAS والتحليل المجهري، على عكس فحوصات البيوكيميائية من الجليكوجين، معلومات بشأن توزيع الجليكوجين في الخلية، والتي يمكن أن تنتشر أو تتركز في جزء معين من الخلية. ومع ذلك، على الرغم من الاختلافات في التقديرات PAS تلطيخ تراكم الجليكوجين بين ظروف مختلفة، فإنه ليس الكمي 11. والأضداد وحيدة النسيلة الماوس في الأصل باستخدام الفك السفلي اللقمة الغضروف كما ثبت مستضد لتتفاعل مع الجليكوجين في الخلايا وتنقيته مع الجليكوجين في المختبر 12. كما تعترف هذه الأجسام المضادة على وجه التحديد سلاسل السكر المرتبطة الجليكوجين، بل هو أداة مفيدة للكشف عن الجليكوجين عن طريق المناعية بطريقة أكثر تحديدا من تلطيخ PAS. </p&gt; المجهر الإلكتروني هو أسلوب آخر أن يسمح التصور من الحبوب من الجليكوجين في الخلايا وتقييم درجة تخزين الجليكوجين. في الواقع، الجليكوجين جسيمات β يمكن التعرف عليها بسهولة مع المجهر الإلكتروني والإلكترون حبيبات كثيفة 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31966.047</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glycogen Assay Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab65620 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		<tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
	 </tr>
		 <tr>
			<td>Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fluorescence Spectrometer</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>LS 50B</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

biochemical titration of glycogen in vitro

الجليكوجين هو بوليمر حيوية الرئيسي من الجلوكوز في الحيوانات الفقارية، ويلعب دورا حاسما في التمثيل الغذائي في الجسم كله، وكذلك في عملية الأيض الخلوية. العديد من الطرق للكشف عن الجليكوجين موجودة بالفعل ولكن فقط عدد قليل من الكمية. نحن هنا وصف طريقة استخدام عدة فحص Abcam الجليكوجين، والتي تقوم على تدهور محددة من الجليكوجين إلى جلوكوز عن طريق غلوكوأميلاز. ثم يتأكسد الجلوكوز خصيصا لمنتج أن يتفاعل مع التحقيق OxiRed لإنتاج مضان. المعايرة دقيقة وحساسة ويمكن أن يتحقق على مقتطفات الخلية أو أقسام الأنسجة. ومع ذلك، وعلى النقيض من تقنيات أخرى، فإنه لا يعطي معلومات حول توزيع الجليكوجين في الخلية. كمثال على هذه التقنية، وصفنا هنا المعايرة من الجليكوجين في اثنين من خطوط الخلايا والصينية CCL39 الليفية الهامستر الرئة والقولون وسرطان الإنسان LS174، المحتضنة في normoxia (21٪ O 2) مقابل نقص الأكسجة (1٪ O 2). افترضنا أن نقص الأكسجين هو سيجنال التي تعد خلايا لتجميع وتخزين الجليكوجين من أجل البقاء على قيد الحياة 1.

وهناك مستوى منخفض من الأكسجين (نقص الأكسجين) في إشارات إلى الخلايا السرطانية الأورام الحاجة إلى تخزين الطاقة للتعامل مع نضوب المغذيات لاحقة، وذلك من أجل البقاء. والجليكوجين هو بوليمر حيوية الرئيسي من الجلوكوز في خلايا الثدييات، درسنا تنظيم تخزين الجليكوجين في نقص ا...

Watch this Scientific Journal Video about Biochemical Titration of Glycogen In vitro at JoVE.com

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

نحن هنا وصف طريقة البيوكيميائية دقيقة وقابلة للتكرار ومريحة للمعايرة من الجليكوجين في المختبر. يستخدم هذا الأسلوب عدة مقايسة Abcam الجليكوجين ويقوم على التحلل المتعاقبة من الجليكوجين إلى جلوكوز والجلوكوز المعايرة من قبل مضان.

المعايرة الكيميائية الحيوية من الجليكوجين<em&gt; في المختبر</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

Research

JoVE Journal

Biology

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

معايرة Coronaviruses الإنسان باستخدام الفحص Immunoperoxidase

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for ...

Zebrafish Brain Ventricle Injection

الزرد حقن الدماغ البطين

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved ...

Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms

جمع متغير تركيز الكالوري المعايرة متحاور مجموعات البيانات من أجل تحديد آليات ملزمة

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Biochemical Reconstitution of Steroid ReceptorÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â¢Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

إعادة إعماره البيوكيميائية من مستقبلات البروتين الستيرويد • المجمعات Hsp90 وإعادة تنشيط يجند تجليد

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

جمع الدم لتحليل الكيمياء الحيوية في الزرد الكبار

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

عزلة البروتينية ريبوسوم الوليدة منضم<em&gt; في المختبر</em&gt; لتحديد المواقع وقفة بالحركة على طول مرنا

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

الكيمياء الحيوية والعليا تقييم مجهرية مرت من كتلة الدهون في<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

فحوصات البيوكيميائية لتحليل أنشطة ATP التي تعتمد على لونين إعادة عرض الانزيمات

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

عالية الإنتاجية المعايرة من luciferase المراسل، معربا عن الفيروسات المؤتلف

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...