Name: biochemical titration of glycogen in vitro
Uploaded: 2013-11-24T19:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biochemical Titration of Glycogen In vitro at JoVE.com

אנו מודים לד&quot;ר טיירי Pourcher על שאפשר לנו להשתמש בספקטרומטר הקרינה ועל עזרתו. המעבדה ממומנת על ידי Ligue Nationale Contre le הסרטן (labellisée Equipe), האיגוד לשפוך la משוכלל ונדיר contre le סרטן, המכון הלאומי du הסרטן (Inca), Nationale סוכנות הידיעות לשפוך la משוכלל ונדיר, METOXIA (תכנית האיחוד האירופי FP7), המרכז א Lacassagne, המרכז הלאומי de la משוכלל ונדיר Scientifique, Institut National de la סנטה et de la משוכלל ונדיר Médicale ואוניברסיטת ניס <a href="http://www.unice.fr/isdbc/" target="_blank">(http://www.unice.fr/isdbc/).</a> אנו מודים לד&quot;ר M כריסטיאן Brahimi-הורן לקריאה ביקורתית ועריכת תיקון.

כותרות ביוכימית של גליקוגן 1. תמוגה תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע בריכוז של 0.5-2 x 10 6 לכל 100 צלחת בקוטר מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול: דגירה תאים 24, 48, או 72 שעות בריכוז הנמוך של חמצן (היפוקס?...

<ol>
	<li>Pelletier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+Synthesis+is+Induced+in+Hypoxia+by+the+Hypoxia-Inducible+Factor+and+Promotes+Cancer+Cell+Survival.">Glycogen Synthesis is Induced in Hypoxia by the Hypoxia-Inducible Factor and Promotes Cancer Cell Survival.</a> Front Oncol. 2, (2012).</li><li>Alonso, M. D., Lomako, J., Lomako, W. M., Whelan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+look+at+the+biogenesis+of+glycogen.">A new look at the biogenesis of glycogen.</a> FASEB J. 9, 1126-1137 (1995).</li><li>Bollen, M., Keppens, S., Stalmans, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+features+of+glycogen+metabolism+in+the+liver.">Specific features of glycogen metabolism in the liver.</a> Biochem. J. 336 (Pt 1), 19-31 (1998).</li><li>Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMP-activated+protein+kinase+does+not+associate+with+glycogen+alpha-particles+from+rat+liver.">AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 362, 811-815 (2007).</li><li>Sullivan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+of+alpha+and+beta+particles+in+glycogen+using+molecular+size+distributions.">Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions.</a> Biomacromolecules. 11, 1094-1100 (2010).</li><li>Chee, N. P., Geddes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+liver+glycogen.">The structure of liver glycogen.</a> FEBS Lett. 73, 164-166 (1977).</li><li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+and+its+metabolism:+some+new+developments+and+old+themes.">Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes.</a> Biochem. J. 441, 763-787 (2012).</li><li>Moses, S. W., Bashan, N., Gutman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+metabolism+in+the+normal+red+blood+cell.">Glycogen metabolism in the normal red blood cell.</a> Blood. 40, 836-843 (1972).</li><li>Agbanyo, M., Taylor, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+3-deoxy-3-fluoro-D-glucose+into+glycogen+and+trehalose+in+fat+body+and+flight+muscle+in+Locusta+migratoria.">Incorporation of 3-deoxy-3-fluoro-D-glucose into glycogen and trehalose in fat body and flight muscle in Locusta migratoria.</a> Biosci. Rep. 6, 309-316 (1986).</li><li>Louzao, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Fluorescent+glycogen"+formation+with+sensibility+for+in+vivo+and+in+vitro+detection.">"Fluorescent glycogen" formation with sensibility for in vivo and in vitro detection.</a> Glycoconj. J. 25, 503-510 (2008).</li><li>Sheehan, D. C. H., B, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histotechnology. , (1980).</li><li>Baba, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibody+that+recognizes+glycogen+and+its+application+for+immunohistochemistry.">Production of monoclonal antibody that recognizes glycogen and its application for immunohistochemistry.</a> Kokubyo Gakkai Zasshi. 60, 264-287 (1993).</li></ol>

טיטרציה ביוכימית של גליקוגן במבחנה מאפשרת כימות מדויק של תוכן גליקוגן בתאים. השוואה לכמה טכניקות אחרות (PAS, immunofluorescence עם נוגדן גליקוגן, וכו &#39;.), טיטרציה זו היא ספציפית מאוד, רגישה ושחזור. יתר על כן, השיטה היא נוחה שכן הוא לא דורש רדיואקטיביות אבל ספקטרומטר הק...

גליקוגן הוא פולימר multibranched של שאריות הגלוקוז, אשר שוהה בציטופלסמה של סוגי תאים רבים. זוהי אחת הצורות העיקריות של אחסון אנרגיה בתאים וממלא תפקיד חשוב בחילוף חומרים של הגלוקוז. רוב תאי היונקים מסוגלים לייצר וגליקוגן חנות, אשר יכול להיות מושפל במהירות לגלוקוז כדי לקדם את ייצור גליקוליזה ו-ATP בלחץ מטבולים. Hepatocytes לייצר כמויות מסיביות של גליקוגן כדי לווסת את רמת הסוכר בדם ובכך לספק אספקה ​​רציפה של גלוקוז בגוף. לעומת זאת, הריכוז של גליקוגן בתאים אחרים (שרירים, תאי דם אדומים, וכו &#39;) הוא נמוך יחסית. עם זאת, באופן מקומי, כמויות אלה מספיקות כדי לספק אנרגיה בטווח הקצר, כאשר התאים נחשפים פתאום לסביבה המקופחת של חומרים מזינים. סינתזה של גליקוגן ופירוק גליקוגן כדלקמן את אותם צעדים בכל הרקמות (איור 1). ראשית, גלוקוזנכנס לתאים על ידי מובילי גלוקוז (עודפים), ומומר במהירות מglucose-6-phosphate (G6P) לגלוקוז-1-פוספט (G1P) על ידי phosphoglucomutase. G1P הוא שונה אז לUDP-גלוקוז, וC1 הפחמן של UDP-גלוקוז מחובר לשאריות טירוזין של glycogenin, חלבון העיגון של גליקוגן. מולקולה זו, הנחשבת לפריימר הגליקוגן, הוארכה על ידי צירופה של UDP-גלוקוז לגלוקוז המסוף ידי α (1 → 4) איגרות חוב באמצעות synthase הגליקוגן. לבסוף, כאשר שרשרת ליניארית של מעל 11 שאריות הגלוקוז נוצר, אנזים ההסתעפות מעביר oligosaccharide מסוף היווה ידי מינימום של 6 שאריות גלוקוז לגלוקוז אחר של השרשרת סמוכה באמצעות הצמדת α (1 → 6). חזרה על התהליך הזה נותן מבנה פרקטלית מאסיבי המכיל ענפים היוצרים סליל עם 6.5 גלוקוז בכל תור. הגליקוגן יכול להיות reversely הידרוליזה לגלוקוז על ידי הפעולה מתואמתשל debranching אנזימים שhydrolyze α (1 → 6) מחויב וphosphorylase גליקוגן שhydrolyzes α (1 → 4) glycosidic כבול בין השאריות האחרונות של גלוקוז של סניף ומולקולת גליקוגן. תגובה זו נקראת &quot;גליקוגנוליסיס מופעלת על ידי הגדלת רמות של AMP (המשקף את צריכת ה-ATP), ומעוכבת על ידי גלוקוז ו-ATP 2,3. על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים, מולקולות גליקוגן תוארו בסוגי תאים רבים חלקיקי β כבחינם (או monoparticles גליקוגן) של 15-30 ננומטר בקוטר. בסוגי תאים ספציפיים, כגון hepatocytes, ניתן להרכיב חלקיקי β למורכבים ליצירת רוזטות, הידוע גם בחלקיקים α המשתנות בקוטר מ 80 ננומטר עד למקסימום של 4 200 ננומטר </sup&gt;. דרך חלקיקי β אלה ערובה ליצירת צבירים גדולים יותר של חלקיקי α עדיין לא הובהרה במלואו. כמה ראיות נוטה להוכיח כי יכולים להיות קשורים חלקיקי β ידי מליטה קוולנטיים 5, מליטה מימן, או אפילו דרך אינטראקציות בין חלבונים 6. כמות הגליקוגן מאוחסן בתאים תלויים בפרמטרים רבים: (i) הסכום של glycogenin בתא שיוזם סינתזת הגליקוגן (ii) את הפעילות של synthase הגליקוגן וphosphorylase מוסדר על ידי זירחון חלבון / dephosphorylation; (שלישי) את הריכוז של גלוקוז בתאים, שהוא תלוי במספר פרמטרים כגון אספקת הגלוקוז ממערכת כלי הדם וספיגת הגלוקוז על ידי תאים. מאגרי הגליקוגן מוסדרים בחוזקה על ידי הרגולציה allosteric של הורמוני biosynthetic דרך מטבוליטים ביניים, על ידי הורמונים המסדירים את חילוף חומרים של אנרגיה, ועל ידי מסלולי איתות חישת מזין 7. חשוב להיותמסוגל לכמת גליקוגן בדגימות ביולוגיות כדי להבין את החשיבות של חילוף חומרים של הגליקוגן בגוף כולו והרמה תאית טוב יותר. אנו מתארים כאן ביוכימית מדויקת, לשחזור ונוחה בassay חוץ גופית לגליקוגן. טכניקה זו מבוססת על הקרינה גלוקוז הכימות לפני ואחרי הידרוליזה ספציפית של גליקוגן. שיטות אחרות קיימות כדי להעריך את הרמה של גליקוגן בתאים, אבל רובם הם לא כמוני. אחת הטכניקות הראשונות שתוארו לכימות של גליקוגן בתאים התבסס על מדידת התאגדות [14 C]-גלוקוז לגליקוגן 8,9. השימוש בקרינה רדיואקטיבית עושה את התהליך הזה קשה יותר להתמודד אבל יש לו את היתרון של מתן שיעור התאגדות גלוקוז לגליקוגן ולהבחין בין ההפצה של שאריות הגלוקוז על הענפים החיצוניים ובליבה של המולקולה (זה גם דורש β-amyloly נוסףאחותי וצעד chromatographic). טכניקה נוספת שפותחה לאחרונה והוא מבוסס על השילוב של 2-NBDG (2 - {N-[7-nitrobenz-2-oxa-1 ,3-diazol-4-י.ל.] אמינו}-2-deoxyglucose), נגזר 2-deoxyglucose ניאון, לגליקוגן 10. עוצמת הקרינה שנמדדה משקפת את כמות הגליקוגן מיוצרת וניתן למדוד עם קורא הקרינה. הפצה של הקרינה בתא גם יכולה להיות מוערכת על ידי מיקרוסקופיה confocal. בין טכניקות nonquantitative האחרות, מכתים תקופתי חומצה שיף (PAS) הוא אולי הנפוץ ביותר. ניתן להשתמש בו לצורך זיהוי של גליקוגן בתאים קבועים, קטעי רקמה בפרפין או קפואים. צבעי טכניקה היסטולוגית זה לא במיוחד סוכרים, glycolipids, גליקופרוטאינים, תאית וmucins הניטרלי בסגול. הסגוליות של בדיקה זו יכולה להיות מוגבר על ידי טיפול בתאים קבועים או חלקי רקמות עם diastase, שדווקא מעכל גליקוגן. לאחר מכן,רמת הגליקוגן ניתן לאמוד באופן איכותי על ידי השוואת דגימות unhydrolyzed (כל מקרומולקולות הפחמימות שונה) לדגימות שעברו הידרוליזה (פחמימות שונה מקרומולקולות מלבד גליקוגן). צביעת PAS וניתוח מיקרוסקופי, בניגוד למבחנים ביוכימיים של גליקוגן, מספק מידע בנוגע להפצה של גליקוגן בתאים, אשר יכול להיות מפוזרת או מרוכזת בחלק מסוים של התא. עם זאת, אף על פי שהבדלי הערכות צביעת PAS בהצטברות גליקוגן בין תנאים שונים, זה לא כמוני 11. נוגדן חד שבטי עכבר במקור נעשה באמצעות סחוס condylar mandibular כאנטיגן הוכח להגיב בגליקוגן בתאים ועם גליקוגן מטוהר במבחנה 12. כנוגדן זה דווקא מכיר בשרשרות סוכר הקשורות לגליקוגן, זה הוא כלי שימושי לזיהוי של הגליקוגן על ידי אימונוהיסטוכימיה באופן ספציפי יותר מאשר צביעת PAS. </p&gt; במיקרוסקופ אלקטרונים הוא טכניקה נוספת שמאפשרת הדמיה של דגנים של גליקוגן בתאים והערכה של מידת אחסון גליקוגן. למעשה, חלקיקי β גליקוגן הם קל לזיהוי עם מיקרוסקופ אלקטרונים כגרגרים צפופים אלקטרון 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31966.047</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glycogen Assay Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab65620 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		<tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
	 </tr>
		 <tr>
			<td>Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fluorescence Spectrometer</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>LS 50B</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

biochemical titration of glycogen in vitro

גליקוגן הוא הפולימר האנרגטי העיקרי של גלוקוז בבעלי חיים בעלי חוליות וממלאים תפקיד מכריע בחילוף חומרים בגוף כולו, כמו גם בחילוף חומרים תאיים. שיטות רבות לאיתור גליקוגן כבר קיימות אבל רק מעטים הם כמוני. אנו מתארים כאן שיטת שימוש בערכת assay Abcam גליקוגן, אשר מבוססת על השפלה ספציפית של הגליקוגן לגלוקוז על ידי glucoamylase. גלוקוז אז במיוחד חמצון למוצר שמגיב עם חללית OxiRed לייצר הקרינה. כותרות היא מדויקות, רגישה ויכולות להיות מושגת על תמציות תא או חלקי רקמות. עם זאת, בניגוד לשיטות אחרות, זה לא נותן מידע על ההפצה של גליקוגן בתאים. כדוגמא לטכניקה זו, שאנו מתארים כאן טיטרציה של גליקוגן בשתי שורות תאים, CCL39 פיברובלסטים ריאות אוגר הסיני וLS174 קרצינומה של המעי הגס האנושי, מודגרות בnormoxia (O 21% 2) לעומת היפוקסיה (1% O 2). חוקרים שערנו כי היפוקסיה היא signal שמכין תאים לסנתז וגליקוגן חנות על מנת לשרוד 1.

רמה נמוכה של חמצן (היפוקסיה) באותות גידולים לתאי גידול את הצורך לאחסן אנרגיה כדי להתמודד עם דלדול מזין שלאחר מכן, כדי לשרוד. כגליקוגן הוא הפולימר האנרגטי העיקרי של גלוקוז בתאי יונקים, שחקרנו את ויסות אחסון הגליקוגן בהיפוקסיה. החישוב וסטנדרטיזציה של הריכוז של גליקוגן ...

Watch this Scientific Journal Video about Biochemical Titration of Glycogen In vitro at JoVE.com

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

אנו מתארים כאן שיטה ביוכימית מדויקת, לשחזור ונוחה לטיטרציה של גליקוגן במבחנה. טכניקה זו משתמשת בערכת assay Abcam גליקוגן והוא מבוסס על הידרוליזה רצופה של הגליקוגן לגלוקוז וגלוקוז טיטרציה על ידי הקרינה.

כותרות ביוכימית של גליקוגן<em&gt; במבחנה</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

Research

JoVE Journal

Biology

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

טיטרציה של נגיפי קורונה האדם שימוש Assay אימונו

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for ...

Zebrafish Brain Ventricle Injection

החדר דג הזברה המוח Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved ...

Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms

איסוף משתנה ריכוז מקורר באופן איזוטרמי Calorimetry טיטרציה מערכי נתונים על מנת לקבוע מנגנונים הכבילה

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Biochemical Reconstitution of Steroid ReceptorÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â¢Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

הכינון ביוכימיים של קולטן סטרואידים • Hsp90 קומפלקסים חלבונים ו מחדש של ליגנד הכבילה

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

הדם אוסף של ניתוח ביוכימי דג הזברה למבוגרים בלבד

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים<em&gt; במבחנה</em&gt; כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

הערכה ביוכימית ותפוקה גבוהה מיקרוסקופית של מסת שומן ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

מבחני ביוכימיים לניתוח פעילויות של ATP תלוי הכרומטין שיפוץ אנזימים

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

כותרות תפוקה גבוהה של וירוסי רקומביננטי לוציפראז- להביע

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...