Name: live cell imaging of early autophagy events: omegasomes and beyond
Uploaded: 2013-07-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond at JoVE.com

ويدعم عملنا من خلال التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية مجلس البحوث. ونود أن نشكر الأستاذ تاموتسو Yoshimori لتوريد تتكرم علينا مع البلازميد للتعبير عن CFP-LC3.

1. إعداد الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور منخفضة عدد مرور الخلايا HEK-293T معربا عن ستابلي GFP-DFCP1 في 22 coverslips على جولة مم؛ خلايا الثقافة بين عشية وضحاها في متوسطة Dulbecco التعديل النسور في (DMEM)، إلى confluency من 30-40٪ (الهدف لconfluency من 80٪ بعد 2 أيام - يوم م?...

<ol>
	<li>Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+process+and+function.">Autophagy: process and function.</a> Genes Dev. 21, 2861-2873 (2007).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Atg+proteins+in+autophagosome+formation.">The role of Atg proteins in autophagosome formation.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27, 107-132 (2011).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+from+phenomenology+to+molecular+understanding+in+less+than+a+decade.">Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 931-937 (2007).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+revisited:+a+conversation+with+Christian+de+Duve.">Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve.</a> Autophagy. 4, 740-743 (2008).</li><li>Yla-Anttilba, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tomography+reveals+connections+between+the+phagophore+and+endoplasmic+reticulum.">3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum.</a> Autophagy. 5, 1180-1185 (2009).</li><li>Hayashi-Nishino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subdomain+of+the+endoplasmic+reticulum+forms+a+cradle+for+autophagosome+formation.">A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation.</a> Nat. Cell Biol. 11, 1433-1437 (2009).</li><li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+in+vivo+analyses+of+cell+function+using+fluorescence+imaging+(*).">Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*).</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 327-332 (2011).</li><li>Mizushima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+autophagosome+formation+using+Apg5-deficient+mouse+embryonic+stem+cells.">Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells.</a> The Journal of Cell Biology. 152, 657-668 (2001).</li><li>Itakura, E., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+autophagosome+formation+site+by+a+hierarchical+analysis+of+mammalian+Atg+proteins.">Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins.</a> Autophagy. 6, 764-776 (2010).</li><li>Axe, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosome+formation+from+membrane+compartments+enriched+in+phosphatidylinositol+3-phosphate+and+dynamically+connected+to+the+endoplasmic+reticulum.">Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum.</a> J Cell Biol. 182, 685-701 (2008).</li><li>Walker, S., Chandra, P., Manifava, M., Axe, E., Ktistakis, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+autophagosomes:+localized+synthesis+of+phosphatidylinositol+3-phosphate+holds+the+clue.">Making autophagosomes: localized synthesis of phosphatidylinositol 3-phosphate holds the clue.</a> Autophagy. 4, 1093-1096 (2008).</li></ol>

الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول يسمح التصور من توطين بروتين خلال تشكيل جسيم بلعمي ذاتي. لقد حاولت وسائل مختلفة من تصور وصف الأحداث بما في ذلك نقطة مسح متحد البؤر، الغزل القرص مبائر وتوتال الإسفار التأمل الداخلي (TIRF) المجهري. لقد وجدنا أن لأغراض عامة القياسية واسعة...

الالتهام الذاتي هو عملية ديناميكية للغاية، الأمر الذي يتطلب التنسيق لعدد كبير من البروتينات لالنتيجة النهائية لتشكيل جسيم بلعمي ذاتي 1-3. المجهري هو على الارجح تقنية تطبيقها الأكثر شيوعا لدراسة الالتهام الذاتي 4. توطين معظم البروتينات الالتهام الذاتي وقد درس على نطاق واسع في الخلايا الثابتة، سواء من جانب المناعية تلطيخ البروتينات الذاتية والتعبير عن الموسومة fluorescently البروتين الخارجية. وبالإضافة إلى ذلك، وقد وصفت المجهر الإلكتروني (EM)، وحده، وبالاشتراك مع وضع العلامات المناعية الذهب، التفاصيل الدقيقة لهذه الهياكل 5،6. على الرغم من حقيقة أن وضعت هذه التقنيات فهمنا لتشكيل جسيم بلعمي ذاتي في الأبعاد 3 من الفضاء، إلا أنهم فشلوا في توفير كمية كافية من المعلومات حول البعد ال 4 - الوقت. تصوير الخلايا الحية يتغلب على هذا الحاجز كما أنه يسمح في أعقاب تشكيل جسيم بلعمي ذاتي أقرب ما possiبلي لفي الوقت الحقيقي 7. كان يعمل هذا الأسلوب الأول لدراسة الالتهام الذاتي من قبل Yoshimori وزملاؤه 8، واستخدمت على نحو متزايد من الآن فصاعدا. الوقت الفاصل بين المجهري يلتقط توطين POI في الخلايا الحية وعلى مدى فترة من الزمن. من خلال مقارنة هذه المعلومات مع الالتهام الذاتي جيدا اتسم و / أو علامة عضية، يمكن تحليل التصوير الخلية الحية وضع POI في سياق المكاني والزماني أكبر من تشكيل جسيم بلعمي ذاتي. ويستند تحليل التصوير الخلية الحية على اسر المتكررة من توطين POI على طول جميع الخطوات من تشكيل جسيم بلعمي ذاتي، في حين يستند التصوير من الخلايا الثابتة على التقاط واحدة. لذلك، يمكن تصوير الخلايا الحية تثبت مساهمة POI في خطوات محددة من تشكيل جسيم بلعمي ذاتي، في حين التصوير من الخلايا الثابتة إلا أن نفترض دور POI، على أساس متوسط ​​التوطين في العديد من autophagosomes القبض في وقت واحد في مراحل مختلفة من lifecy بهمكلي. على الرغم من أن التصوير الخلية الحية هي طريقة لقوة تحليلية عالية، لديها بعض القيود المتأصلة، التي ينبغي أن تؤخذ بعين الاعتبار. بادئ ذي بدء، تصوير الخلايا الحية يتطلب التعبير عن واحد أو أكثر من البروتينات الخارجية fluorescently المسمى. به نيون تميل إلى أن تكون كبيرة في حجمها وأنها يمكن أن يغير في بعض الأحيان سلوك من البروتين وذلك لأسباب الفراغية. ويتفاقم هذا الوضع بالنسبة للبروتينات الغشاء، لأنها تحتاج لتعمل في مساحة محدودة من أبعاد 2 من الأغشية. من المذكرة، autophagosomes هي هياكل غشائي، وفقا لتكوينها يتطلب عددا كبيرا من البروتينات المرتبطة الغشاء. يتم توصيل مجموعة أخرى من المشاكل إلى مستويات التعبير من POI. من حيث المبدأ، ينبغي التعبير عن بروتين الخارجية عند مستويات مماثلة لبروتين الذاتية. وهذا يضمن أن المنظمين هامة للتوطين في شبه الخلوية لن تكون مشبعة، وعشرةوتحليل ه تكون ذات صلة من الناحية البيولوجية. وعلاوة على ذلك، ينبغي تجنب overexpression من البروتينات الالتهام الذاتي، كما هو الحال عندما يتم التعبير عنها فوق المستويات المحلية، فإنها تميل إلى تثبيط استجابة الالتهام الذاتي 9. وعلى العكس، منذ مستويات التعبير عن POI ينبغي أن تكون عالية بما يكفي للسماح بعد الأقلمة الذي تضطلع به لفترة جيدة من الوقت بدون صورة تبيض، حلا وسطا لابد من التوصل إليها. تحقيق مستويات التعبير الأمثل من البروتين في الخلايا الخارجية mammalians يتطلب الكثير من ضبط، ولكن كان من الممكن من خلال إنشاء وفحص خطوط الخلايا معربا عن ستابلي مستويات مختلفة من POI. القرار المكانية التي لا يمكن أن يتحقق مع المجهري مضان هو معيار عامل آخر يحد. قد يكون القرار محدودة لعدد من الأسباب، ولكن في أحسن الأحوال، سوف يكون القرار الجانبي حوالي 250 نانومتر. وهذا يعني أن أي أجسام مفصولة مسافة أصغر من هذا سوف تظهر متصلة (أو كوحدة واحدةكائن) وكائنات أصغر من 250 نانومتر سوف تكون ممثلة في الصورة أكبر مما هي عليه في الواقع. ولذلك ينبغي دائما أن تفسر الصور مع هذا في الاعتبار، وسوف تكون هناك حاجة تقنيات تكميلية مثل EM لحل التفاصيل فائقة الهيكلية غرامة. وأخيرا، تصوير الخلايا الحية يتطلب بطبيعته تعريض الخلايا للضوء، ويحتمل أن تكون لفترة طويلة من الزمن. وهذا قد يغير من الاستجابات الفسيولوجية للخلية، وهي ظاهرة تعرف باسم صورة سمية. لقد استخدمت بنجاح التصوير الخلية الحية من البروتين PI3P ملزم DFCP1 لوصف للمرة الأولى التي تنشأ من autophagosomes الغنية PI3P مثل خاتم الهياكل omegasomes يطلق عليه، والتي هي في ارتباط وثيق مع فروع ER 10،11. لقد أظهرنا بوضوح أن هياكل إيجابية LC3 بدء تشكيل في ارتباط وثيق مع omegasomes. نقترح هنا أن توظيف خط خلية معربا عن GFP ثابت-DFCP1 للخلية الحيةالتصوير من البروتين من الفائدة، ويضع الإطار المكاني والزماني قوي لتوصيف دورها في تشكيل جسيم بلعمي ذاتي.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>OptiMEM I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-062</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MitoTracker Red FM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M22425</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LysoTracker Red DND-99</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L-7528</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>22 mm coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0159</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm plates</td>
			<td>Fisher NUNC</td>
			<td>153066</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Silicon grease</td>
			<td>RS Components Ltd. </td>
			<td>RS 494-124</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>O-rings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-7816</td>
			<td>Suggested alternative to custom-made O-rings</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO 100XO</td>
			<td>N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA-R2 C10600 10B</td>
			<td>Progressive scan interline CCD</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Illuminator</td>
			<td>TILL Photonics</td>
			<td>Polychrome V</td>
			<td>Ultrafast monochromator</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Incubation chamber</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td>Cell^R IX81</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SIS xcellence</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

live cell imaging of early autophagy events: omegasomes and beyond

الالتهام الذاتي هو استجابة الخلوية الناجمة عن نقص المواد الغذائية، وخاصة لعدم وجود الأحماض الأمينية. يتم تعريف الالتهام الذاتي من قبل تشكيل هياكل غشاء مزدوج، ودعا autophagosomes، أن تنحية السيتوبلازم والبروتينات طويلة الأمد والمجاميع البروتين، العضيات معيب، وحتى الفيروسات أو البكتيريا. Autophagosomes تلتحم في نهاية المطاف مع الجسيمات الحالة مما يؤدي إلى تدهور الجزء الأكبر من محتواها، مع المواد الغذائية المنتجة التي يجري إعادة تدويرها مرة أخرى إلى السيتوبلازم. ولذلك، الالتهام الذاتي هو أمر حاسم لتوازن الخلية، والتقلبات من الالتهام الذاتي يمكن أن يؤدي إلى المرض، وأبرزها تنكس عصبي والشيخوخة والسرطان. تشكيل جسيم بلعمي ذاتي هو عملية معقدة جدا، لالخلايا التي خصصت مجموعة معينة من البروتينات، ودعا الآلية الأساسية الالتهام الذاتي. الآلية الأساسية الالتهام الذاتي ويكمل وظيفيا من البروتينات إضافية تشارك في العمليات الخلوية المتنوعة، على سبيل المثال في MEMBRANالاتجار ه، في علم الأحياء الميتوكوندريا والليزوزومية. التنسيق بين هذه البروتينات لتشكيل وتدهور autophagosomes يشكل استجابة ديناميكية للغاية ومتطورة من الالتهام الذاتي. تصوير الخلايا الحية يسمح احد لمتابعة مساهمة الجزيئي للبروتين كل المتصلة الالتهام الذاتي وصولا الى مستوى حدثا تشكيل جسيم بلعمي ذاتي واحد وفي الوقت الحقيقي، وبالتالي هذه التقنية توفر دقة الزمانية والمكانية العالية. هنا نستخدم خط خلية معربا عن GFP-DFCP1 ثابت، لتأسيس السياق المكاني والزماني لتحليلنا. DFCP1 علامات omegasomes، التي هي هياكل السلائف تؤدي إلى تشكيل autophagosomes. يمكن أن تكون علامة A البروتين من الفائدة (POI) مع إما أحمر أو أزرق سماوي علامة فلوري. العضيات المختلفة، مثل ER، الميتوكوندريا والجسيمات الحالة، وتشارك في جميع الخطوات المختلفة من تشكيل جسيم بلعمي ذاتي، ويمكن أن تكون علامة باستخدام صبغة تعقب محددة. الوقت الفاصل بين المجهري من AUTOPهاجي في هذه المجموعة التجريبية أعلى، يسمح للمعلومات ليكون استخراجه عن البعد الرابع، أي وقت. ومن هنا يمكننا أن اتباع مساهمة POI إلى الالتهام الذاتي في المكان والزمان.

في وصف البروتوكول، ونحن قد استخدمت الوقت الفاصل بين المجهري لمتابعة توطين CFP الموسومة LC3 في خط خلية معربا عن ستابلي GFP الموسومة DFCP1، في ظل ظروف حمل الالتهام الذاتي. نتائج هذه التجربة هو القبض على 2 سلسلة أو رزمة من الصور، واحدة من الأخضر واحد من القناة الزرقاء، الموافق G...

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond at JoVE.com

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

الوقت الفاصل بين المجهري من علامات الالتهام الذاتي fluorescently المسمى يسمح رصد استجابة الالتهام الذاتي ديناميكية مع القرار الزماني عالية. باستخدام الالتهام الذاتي محددة وعلامات عضية في مزيج من 3 ألوان مختلفة، ونحن يمكن أن يتبع مساهمة بروتين لتشكيل جسيم بلعمي ذاتي في سياق المكاني والزماني قوية.

يعيش التصوير خلية من الأحداث الالتهام الذاتي المبكر: Omegasomes وما بعدها

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

يعيش تصوير ذبابة الفاكهة السوداء البطن هجرات كرية دموية الجنينية

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

الحنق المجهر لمراقبة الوقت الحقيقي من أحداث في اشارة الخلايا الحية باستخدام أجهزة الاستشعار Unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

عامين والتصوير الثلاثي الابعاد لايف خلية من البروتينات DNA الاستجابة الأضرار

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D التصوير التجميع البروتين في الخلايا الحية

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

تفعيل الالتهام الذاتي من قبل بممارسة الهوائية في الفئران

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

توصيف تكلس الأحداث عن طريق لايف البصرية والمجهر الإلكتروني تقنيات في Tubeworm البحرية

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

تصوير الخلايا الحية من تحبيب الصفائح الدموية والإفراز تحت التدفق

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

تطبيق غشاء وجدار الخلية الاصباغ الفلورية الانتقائية لتصوير الخلايا الحية من الفطريات الخيطية

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

فائقة الدقة تصوير الخلايا الحية من الهياكل دون الخلوية

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...