Name: live cell imaging of early autophagy events: omegasomes and beyond
Uploaded: 2013-07-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond at JoVE.com

Notre travail est soutenu par la biotechnologie et du Conseil de recherche en sciences biologiques. Nous tenons à remercier le Professeur Tamotsu Yoshimori de bien vouloir nous fournir avec le plasmide pour l&#39;expression de la CFP-LC3.

1. Préparation des cellules <ol><li> Seed faible nombre de passages des cellules HEK-293T exprimant de façon stable GFP-DFCP1 22 lamelles rondes mm, les cellules de culture de la nuit dans du milieu de Dulbecco modifié Eagles (DMEM), à une confluence de 30-40% (objectif pour une confluence de 80% après 2 jours - jour de l&#39;imagerie des cellules vivantes). </li></ol> 2. La transfection cellulaire <ol><li> Préparer le mélange complexe de transfection pour chaque plaque, contenant 100 ...

<ol>
	<li>Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+process+and+function.">Autophagy: process and function.</a> Genes Dev. 21, 2861-2873 (2007).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Atg+proteins+in+autophagosome+formation.">The role of Atg proteins in autophagosome formation.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27, 107-132 (2011).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+from+phenomenology+to+molecular+understanding+in+less+than+a+decade.">Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 931-937 (2007).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+revisited:+a+conversation+with+Christian+de+Duve.">Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve.</a> Autophagy. 4, 740-743 (2008).</li><li>Yla-Anttilba, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tomography+reveals+connections+between+the+phagophore+and+endoplasmic+reticulum.">3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum.</a> Autophagy. 5, 1180-1185 (2009).</li><li>Hayashi-Nishino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subdomain+of+the+endoplasmic+reticulum+forms+a+cradle+for+autophagosome+formation.">A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation.</a> Nat. Cell Biol. 11, 1433-1437 (2009).</li><li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+in+vivo+analyses+of+cell+function+using+fluorescence+imaging+(*).">Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*).</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 327-332 (2011).</li><li>Mizushima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+autophagosome+formation+using+Apg5-deficient+mouse+embryonic+stem+cells.">Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells.</a> The Journal of Cell Biology. 152, 657-668 (2001).</li><li>Itakura, E., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+autophagosome+formation+site+by+a+hierarchical+analysis+of+mammalian+Atg+proteins.">Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins.</a> Autophagy. 6, 764-776 (2010).</li><li>Axe, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosome+formation+from+membrane+compartments+enriched+in+phosphatidylinositol+3-phosphate+and+dynamically+connected+to+the+endoplasmic+reticulum.">Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum.</a> J Cell Biol. 182, 685-701 (2008).</li><li>Walker, S., Chandra, P., Manifava, M., Axe, E., Ktistakis, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+autophagosomes:+localized+synthesis+of+phosphatidylinositol+3-phosphate+holds+the+clue.">Making autophagosomes: localized synthesis of phosphatidylinositol 3-phosphate holds the clue.</a> Autophagy. 4, 1093-1096 (2008).</li></ol>

La méthode décrite dans ce protocole permet la visualisation de la localisation d&#39;une protéine pendant la formation autophagosome. Nous avons essayé différentes méthodes de visualisation des événements décrits, y compris point confocale à balayage, la filature disque confocale et Total Internal Reflection Fluorescence de la route (FRBR) de microscopie. Nous avons constaté que pour les fins générales de norme à grand champ épi-fluorescence offre le meilleur compromis entre la sensibilité et la résolu...

L&#39;autophagie est un processus très dynamique, ce qui nécessite la coordination d&#39;un grand nombre de protéines pour le résultat final de formation autophagosome 1-3. La microscopie est probablement la technique la plus couramment utilisée pour étudier l&#39;autophagie 4. La localisation de la plupart des protéines autophagie a été étudiée dans des cellules fixées, tant par immuno-coloration des protéines endogènes et par l&#39;expression de protéines marquées par fluorescence exogène. En outre, la microscopie électronique (EM), seul et en combinaison avec l&#39;étiquetage immuno-or, a décrit les détails les plus fins de ces structures 5,6. Malgré le fait que ces techniques ont mis en place notre compréhension de la formation autophagosome dans les 3 dimensions de l&#39;espace, ils n&#39;ont pas réussi à fournir une quantité suffisante d&#39;informations sur la 4 ème dimension - le temps. Imagerie des cellules vivantes surmonte cet obstacle car il permet de suivre la formation d&#39;un autophagosome aussi proche que possibleble en temps réel 7. Cette technique a été employée la première à étudier l&#39;autophagie par Yoshimori et ses collègues 8, et a été de plus en plus recours à l&#39;avenir. Microscopie time-lapse capte la localisation du point d&#39;intérêt dans des cellules vivantes et sur une période de temps. En comparant ces informations avec un autophagie bien caractérisé et / ou organite marqueur, l&#39;analyse de l&#39;imagerie des cellules vivantes peut mettre le POI dans le contexte spatial et temporel plus élevé de formation autophagosome. Analyse d&#39;imagerie de cellules vivantes sont basées sur la saisie répétitive de la localisation de points d&#39;intérêt le long de toutes les étapes de la formation autophagosome, tandis que l&#39;imagerie de cellules fixées sont basées sur une seule prise. Par conséquent, imagerie des cellules vivantes peut prouver la contribution du POI à des étapes spécifiques de formation autophagosome, tandis que l&#39;imagerie des cellules fixes ne peut assumer le rôle de POI, en fonction de sa localisation moyenne dans de nombreux autophagosomes capturées simultanément à différents stades de leur lifecycle. Bien que l&#39;imagerie des cellules vivantes est une méthode de puissance analytique de haut, il a quelques limitations inhérentes, qui devraient être prises en considération. Tout d&#39;abord, l&#39;imagerie de cellules vivantes nécessite l&#39;expression d&#39;une ou plusieurs protéines marquées par fluorescence exogène. Marqueurs fluorescents ont tendance à être de grande taille et ils peuvent parfois modifier le comportement d&#39;une protéine pour des raisons stériques. Cette situation est accentuée pour des protéines membranaires, comme ils ont besoin pour fonctionner dans l&#39;espace limité des 2 dimensions de membranes. Fait à noter, autophagosomes sont des structures membraneuses, et en conséquence leur formation nécessite un grand nombre de protéines associées à la membrane. Une autre série de problèmes est lié aux niveaux d&#39;expression de la PI. En principe, une protéine exogène doit être exprimée à des niveaux comparables à la protéine endogène. Cela garantit que les régulateurs importants de sa localisation sub-cellulaire ne seront pas saturés, et eanalyse des e sera biologiquement pertinent. En outre, la surexpression de protéines autophagie doit être évitée, car quand ils sont exprimés au-dessus des niveaux endogènes, ils ont tendance à inhiber la réponse autophagie 9. En revanche, puisque les niveaux d&#39;expression de la POI doit être suffisamment élevé pour permettre de suivre sa localisation pour une bonne période de temps sans photo-blanchiment, un compromis doit être atteint. Atteindre les niveaux d&#39;expression optimale d&#39;une protéine exogène dans les cellules mammifères nécessite beaucoup de réglage fin, mais il est possible en établissant et de criblage des lignées cellulaires exprimant de façon stable différents niveaux du POI. La résolution spatiale qui peut être réalisé avec la microscopie à fluorescence standard est un autre facteur limitant. Résolution peut être limitée à un certain nombre de raisons, mais, au mieux, la résolution latérale sera autour de 250 nm. Cela signifie que tous les objets séparés par une distance inférieure à ce apparaîtront connecté (ou comme une seuleobjet) et des objets plus petits que 250 nm seront représentés dans l&#39;image plus grande que ce qu&#39;ils sont réellement. Par conséquent images doivent toujours être interprétés avec cela à l&#39;esprit et des techniques complémentaires telles que l&#39;EM seront nécessaires pour résoudre les petits détails ultra-structurelle. Enfin, l&#39;imagerie de cellules vivantes nécessite intrinsèquement exposition d&#39;une cellule à la lumière, éventuellement pendant une période de temps prolongée. Cela peut modifier les réponses physiologiques d&#39;une cellule, un phénomène connu sous le nom de photo-toxicité. Nous avons utilisé avec succès imagerie des cellules vivantes de la protéine PI3P contraignant DFCP1 de décrire pour la première fois que autophagosomes proviennent de PI3P riches en structures en forme d&#39;anneau omegasomes appelés, qui sont en étroite association avec ER brins 10,11. Nous avons clairement montré que les structures LC3-positifs commencent à se former en association étroite avec omegasomes. Nous suggérons ici que l&#39;utilisation d&#39;une lignée cellulaire stable exprimant la GFP-DFCP1 pour la cellule en directimagerie de la protéine d&#39;intérêt, établit un cadre spatial et temporel robuste pour la caractérisation de son rôle dans la formation autophagosome.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>OptiMEM I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-062</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MitoTracker Red FM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M22425</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LysoTracker Red DND-99</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L-7528</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>22 mm coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0159</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm plates</td>
			<td>Fisher NUNC</td>
			<td>153066</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Silicon grease</td>
			<td>RS Components Ltd. </td>
			<td>RS 494-124</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>O-rings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-7816</td>
			<td>Suggested alternative to custom-made O-rings</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO 100XO</td>
			<td>N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA-R2 C10600 10B</td>
			<td>Progressive scan interline CCD</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Illuminator</td>
			<td>TILL Photonics</td>
			<td>Polychrome V</td>
			<td>Ultrafast monochromator</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Incubation chamber</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td>Cell^R IX81</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SIS xcellence</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

live cell imaging of early autophagy events: omegasomes and beyond

Autophagy est une réponse cellulaire déclenchée par le manque de nutriments, en particulier de l&#39;absence d&#39;acides aminés. Autophagy est définie par la formation de structures à double membrane, appelée autophagosomes, qui séquestrent cytoplasme, des protéines à vie longue et des agrégats de protéines, des organites défectueux, et même les virus ou les bactéries. Autophagosomes finalement fusionnent avec les lysosomes entraînant une dégradation majeure partie de leur contenu, les éléments nutritifs produits recyclés vers le cytoplasme. Par conséquent, l&#39;autophagie est essentielle pour l&#39;homéostasie cellulaire, et des dérèglements de l&#39;autophagie peut conduire à la maladie, notamment la neurodégénérescence, le vieillissement et le cancer. Autophagosome formation est un processus très complexe, pour lequel les cellules ont alloué un groupe spécifique de protéines, appelées les machines de l&#39;autophagie de base. Le mécanisme de l&#39;autophagie de base est complété par des protéines fonctionnellement supplémentaires impliquées dans divers processus cellulaires, par exemple dans membrane trafic, en biologie mitochondriale et lysosomale. La coordination de ces protéines pour la formation et la dégradation des autophagosomes constitue la réponse très dynamique et sophistiqué de l&#39;autophagie. Imagerie de cellules vivantes permet de suivre la contribution moléculaire de chaque protéine autophagie liée vers le bas au niveau d&#39;un seul événement de formation autophagosome et en temps réel, par conséquent, cette technique offre une résolution temporelle et spatiale. Ici, nous utilisons une lignée cellulaire exprimant de façon stable GFP-DFCP1, d&#39;établir un contexte spatial et temporel pour notre analyse. DFCP1 marques omegasomes, qui sont des structures précurseurs conduisant à la formation de autophagosomes. Une protéine d&#39;intérêt (POI) peut être marqué d&#39;une croix rouge ou marqueur fluorescent cyan. Différents organelles, comme la ER, les mitochondries et les lysosomes, sont tous impliqués dans les différentes étapes de formation autophagosome, et peuvent être marqués en utilisant un colorant de traçage spécifique. Microscopie time-lapse de autophagy dans ce dispositif expérimental, permet aux informations d&#39;être extrait de la quatrième dimension, c&#39;est à dire le temps. Ainsi, nous pouvons suivre la contribution du POI à l&#39;autophagie dans l&#39;espace et le temps.

Dans le protocole décrit, nous avons utilisé la microscopie time-lapse de suivre la localisation de CFP-étiqueté LC3 dans une lignée cellulaire exprimant de façon stable GFP-étiquetée DFCP1, dans des conditions d&#39;induction de l&#39;autophagie. Le résultat de cette expérience est la capture de 2 séries ou piles d&#39;images, l&#39;une du vert et l&#39;autre du canal bleu, correspondant à la GFP-DFCP1 et CFP-LC3. Nous avons également analysé ces vidéos en utilisant ImageJ, afin de créer des montages co...

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond at JoVE.com

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Microscopie time-lapse de marqueurs de l&#39;autophagie marquées par fluorescence permet le suivi de la réponse de l&#39;autophagie dynamique avec une haute résolution temporelle. Utilisation de l&#39;autophagie spécifique et marqueurs organites dans une combinaison de 3 couleurs différentes, nous pouvons suivre la contribution d&#39;une protéine à la formation autophagosome dans un contexte spatial et temporel robuste.

Vivre imagerie cellulaire de l&#39;autophagie premiers événements: Omegasomes et au-delà

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

En direct de l&#39;imagerie Drosophila melanogaster Migrations hémocytaires embryonnaires

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Recherche

Biologie

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET microscopie pour Surveillance en temps réel des événements de signalisation dans les cellules vivantes en utilisant Biocapteurs unimoléculaires

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Deux et trois dimensions imagerie de cellules vivantes de protéines endommagent l&#39;ADN de réponse

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D imagerie de l&#39;agrégation des protéines dans les cellules vivantes

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Vivre imagerie de dédouanement cellulaire par apoptose au cours<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenèse

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Activation autophagie par exercice aérobie chez la souris

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Caractérisation de calcification Events Utilisation en direct optiques et Electron Microscopy Techniques dans un tubeworm Marine

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Imagerie en cellules vivantes de la dégranulation et de la sécrétion de plaquettes sous le flux

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

Application de colorants fluorescents sélectifs de membrane et de mur cellulaire pour l'imagerie de cellules vivantes des champignons filamenteux

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

Imagerie de cellules vivantes à super-résolution de structures subcellulaires

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...