Name: live cell imaging of early autophagy events: omegasomes and beyond
Uploaded: 2013-07-27T14:00:00
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Unsere Arbeit wird unterstützt von der Biotechnology and Biological Sciences Research Council unterstützt. Wir möchten Prof Tamotsu Yoshimori für die freundliche Bereitstellung uns mit dem Plasmid für die Expression von GFP-LC3 danken.

1. Zellpräparation <ol><li> Seed niedrigen Durchgang Zahl der HEK-293T-Zellen, die GFP-DFCP1 auf 22 mm runde Deckgläser, Kultur Zellen über Nacht in Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), bis zu einer Konfluenz von 30-40% (Ziel für eine Konfluenz von 80% nach 2 Tage - Tag des Live Cell Imaging). </li></ol> 2. Zelltransfektion <ol><li> Bereiten Sie die Transfektion komplexe Mischung für jede Platte, die 100 ul OptiMEM I reduziert Serummedium, 3 ul X-tremeGENE 9 DNA-Transfektionsreage...

<ol>
	<li>Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+process+and+function.">Autophagy: process and function.</a> Genes Dev. 21, 2861-2873 (2007).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Atg+proteins+in+autophagosome+formation.">The role of Atg proteins in autophagosome formation.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27, 107-132 (2011).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+from+phenomenology+to+molecular+understanding+in+less+than+a+decade.">Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 931-937 (2007).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+revisited:+a+conversation+with+Christian+de+Duve.">Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve.</a> Autophagy. 4, 740-743 (2008).</li><li>Yla-Anttilba, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tomography+reveals+connections+between+the+phagophore+and+endoplasmic+reticulum.">3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum.</a> Autophagy. 5, 1180-1185 (2009).</li><li>Hayashi-Nishino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subdomain+of+the+endoplasmic+reticulum+forms+a+cradle+for+autophagosome+formation.">A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation.</a> Nat. Cell Biol. 11, 1433-1437 (2009).</li><li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+in+vivo+analyses+of+cell+function+using+fluorescence+imaging+(*).">Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*).</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 327-332 (2011).</li><li>Mizushima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+autophagosome+formation+using+Apg5-deficient+mouse+embryonic+stem+cells.">Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells.</a> The Journal of Cell Biology. 152, 657-668 (2001).</li><li>Itakura, E., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+autophagosome+formation+site+by+a+hierarchical+analysis+of+mammalian+Atg+proteins.">Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins.</a> Autophagy. 6, 764-776 (2010).</li><li>Axe, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosome+formation+from+membrane+compartments+enriched+in+phosphatidylinositol+3-phosphate+and+dynamically+connected+to+the+endoplasmic+reticulum.">Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum.</a> J Cell Biol. 182, 685-701 (2008).</li><li>Walker, S., Chandra, P., Manifava, M., Axe, E., Ktistakis, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+autophagosomes:+localized+synthesis+of+phosphatidylinositol+3-phosphate+holds+the+clue.">Making autophagosomes: localized synthesis of phosphatidylinositol 3-phosphate holds the clue.</a> Autophagy. 4, 1093-1096 (2008).</li></ol>

Das Verfahren in diesem Protokoll beschrieben ermöglicht die Visualisierung von Lokalisation eines Proteins während Autophagosom Bildung. Wir haben verschiedene Methoden der Visualisierung die Ereignisse beschrieben, einschließlich Point-konfokalen, Spinning Disk konfokalen und Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Mikroskopie versucht. Wir haben festgestellt, dass für allgemeine Zwecke Standard Weitfeld-Auflicht-Fluoreszenz den besten Kompromiss zwischen Empfindlichkeit und Auflösung bietet. Dies gewährle...

Autophagie ist ein sehr dynamischer Prozess, der die Koordination einer Vielzahl von Proteinen für das Endergebnis von 1-3 Autophagosom Bildung erfordert. Mikroskopie ist wahrscheinlich die Technik am häufigsten für das Studium Autophagie 4 angelegt. Die Lokalisierung der meisten autophagy Proteine ​​wurde ausführlich in fixierten Zellen untersucht, sowohl durch Immunfärbung der endogenen Proteinen und durch die Expression von exogenen fluoreszenzmarkierten Protein. Darüber hinaus hat Elektronenmikroskopie (EM), allein und in Kombination mit Immun-Gold-Kennzeichnung, die feinen Details dieser Strukturen 5,6 beschrieben. Trotz der Tatsache, dass diese Techniken haben unser Verständnis der Autophagosom Bildung in den 3 Dimensionen des Raumes gegründet, haben sie es versäumt, ausreichende Menge an Informationen über die 4. Dimension geben - Zeit. Live Cell Imaging überwindet diese Barriere, wie es im Anschluss an die Bildung einer Autophagosom so nah wie möglich erlaubtble in Echtzeit 7. Diese Technik wurde erstmals eingesetzt, um durch Autophagie Yoshimori und Kollegen 8 zu studieren, und wurde fortan zunehmend genutzt. Zeitraffer-Mikroskopie fängt die Lokalisation des POI in lebenden Zellen und über einen Zeitraum von Zeit. Durch den Vergleich dieser Informationen mit einem gut charakterisierten Autophagie und / oder Organellen Marker können Live Cell Imaging Analyse des POI in der größeren räumlichen und zeitlichen Kontext Autophagosom Bildung setzen. Live Cell Imaging Analyse basiert auf der wiederholten Erfassung des POI Lokalisation entlang aller Schritte Autophagosom Bildung basiert, während Bildgebung von fixierten Zellen auf einer einzigen Erfassung beruht. Daher kann Live Cell Imaging beweisen den Beitrag des POI in bestimmten Schritten Autophagosom Bildung, während Bildgebung von fixierten Zellen nur annehmen, kann die Rolle der POI, basierend auf den durchschnittlichen Lokalisation in vielen Autophagosomen gleichzeitig gefangen in den verschiedenen Phasen ihres Lifecyclecle. Obwohl Live Cell Imaging ist eine Methode der hohe analytische Leistung, hat es einige inhärente Beschränkungen, die in Betracht gezogen werden sollte. Zunächst erfordert lebenden Zellen die Expression eines oder mehrerer exogener fluoreszenzmarkierten Proteinen. Fluoreszierenden Markierungen sind in der Regel in der Größe groß und können manchmal verändern das Verhalten eines Proteins durch sterische Gründe. Diese Situation ist für Membranproteine ​​akzentuiert, wie sie in den begrenzten Raum der 2 Dimensionen von Membranen funktionieren müssen. Zu beachten ist, sind Autophagosomen membranösen Strukturen und dementsprechend ihre Bildung erfordert eine große Anzahl von Membran-assoziierten Proteinen. Weitere Probleme mit der Expression des POI verbunden. Grundsätzlich sollte ein exogenes Protein auf einem Niveau vergleichbar mit dem endogenen Protein exprimiert werden. Dadurch wird sichergestellt, dass wichtige Regulatoren der sub-zelluläre Lokalisation nicht gesättigt, und the Analyse wird biologisch relevant. Darüber hinaus sollte die Überexpression von Autophagie Proteine ​​vermieden werden, da, wenn sie über den endogenen ausgedrückt werden, sie den Autophagie Antwort 9 hemmen neigen. Umgekehrt, da die Expression des POI sollte hoch genug sein, um nach ihrer Lokalisation für eine gute Zeit ohne Fotobleichen ermöglichen, muss ein Kompromiss erzielt werden. Das Erreichen der optimalen Expression eines exogenen Protein in Säugern Zellen erfordert eine Menge Feinabstimmung, aber es ist machbar durch die Errichtung und Screening-Zelllinien stabil exprimiert verschiedenen Ebenen des POI. Die räumliche Auflösung, die mit Standard-Fluoreszenz-Mikroskopie erreicht werden kann, ist ein weiterer limitierender Faktor. Auflösung kann für eine Reihe von Gründen begrenzt ist, sondern bestenfalls laterale Auflösung wird etwa 250 nm liegen. Dies bedeutet, dass alle Objekte in einem Abstand kleiner als dieser getrennt erscheint verbunden (oder als eine einzigeObjekt) und Objekte, die kleiner als 250 nm wird in das Bild größer als sie tatsächlich sind vertreten. Daher Bilder sollten immer in diesem Sinne interpretiert werden und ergänzende Techniken wie EM wird benötigt, um ultra-feine strukturelle Details zu klären. Schließlich lebenden Zellen von Natur erfordert Aussetzen einer Zelle, um Licht, möglicherweise über einen längeren Zeitraum. Dies hat Auswirkungen auf die physiologischen Reaktionen einer Zelle, ein Phänomen, das als Phototoxizität bekannt. Wir haben erfolgreich Live Cell Imaging der PI3P-binding protein DFCP1 verwendet, um zum ersten Mal, dass Autophagosomen von PI3P-reich ring-ähnlichen Strukturen bezeichnet omegasomes, die in enger Zusammenarbeit mit ER Stränge 10,11 sind stammen beschreiben. Wir haben klar gezeigt, dass LC3-positiven Strukturen bilden in enger Zusammenarbeit mit omegasomes starten. Wir vermuten, dass hier unter Verwendung einer Zelllinie stabil exprimieren GFP-DFCP1 für die lebenden ZellenAbbildung des interessierenden Proteins, wurde eine stabile räumliche und zeitliche Rahmen für die Charakterisierung ihrer Rolle in Autophagosom Bildung.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>OptiMEM I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-062</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MitoTracker Red FM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M22425</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LysoTracker Red DND-99</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L-7528</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>22 mm coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0159</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm plates</td>
			<td>Fisher NUNC</td>
			<td>153066</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Silicon grease</td>
			<td>RS Components Ltd. </td>
			<td>RS 494-124</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>O-rings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-7816</td>
			<td>Suggested alternative to custom-made O-rings</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO 100XO</td>
			<td>N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA-R2 C10600 10B</td>
			<td>Progressive scan interline CCD</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Illuminator</td>
			<td>TILL Photonics</td>
			<td>Polychrome V</td>
			<td>Ultrafast monochromator</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Incubation chamber</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td>Cell^R IX81</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SIS xcellence</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

live cell imaging of early autophagy events: omegasomes and beyond

Autophagy eine zelluläre Antwort durch das Fehlen von Nährstoffen, insbesondere das Fehlen von Aminosäuren ausgelöst. Autophagie wird durch die Bildung von Doppel-Membran-Struktur, genannt Autophagosomen, das Zytoplasma, langlebigen Proteinen und Protein-Aggregate, fehlerhafte Organellen und sogar Viren oder Bakterien absondern definiert. Autophagosomen schließlich mit Lysosomen, die zu Masse Verschlechterung ihrer Inhalte zu verschmelzen, wobei die Nährstoffe erzeugt werden zurück in das Zytoplasma zurückgeführt. Daher ist von entscheidender Bedeutung für Autophagie Zellhomöostase und Fehlregulation von Autophagie kann zu Krankheiten, vor allem Neurodegeneration, Alterung und Krebs führen. Autophagosom Bildung ist ein sehr aufwendiges Verfahren, bei denen Zellen haben eine bestimmte Gruppe von Proteinen, die so genannte Kern Autophagie Maschinen zugeordnet. Der Kern Autophagie Maschinen funktional durch zusätzliche Proteine ​​in verschiedenen zellulären Prozessen beteiligt ergänzt, z. B. in membrane Menschenhandel in der mitochondrialen und lysosomalen Biologie. Die Koordination dieser Proteine ​​für die Bildung und den Abbau von Autophagosomen bildet den hochdynamischen und anspruchsvolle Reaktion der Autophagie. Live Cell Imaging ermöglicht es, die molekularen Beitrag jedes Autophagie-related protein folgen bis auf die Ebene eines einzelnen Autophagosom Bildung Veranstaltung und in Echtzeit, daher bietet diese Technik eine hohe zeitliche und räumliche Auflösung. Hier verwenden wir eine Zelllinie stabil exprimieren GFP-DFCP1, um einen räumlichen und zeitlichen Kontext für unsere Analyse zu etablieren. DFCP1 Marken omegasomes, die Vorläufer-Strukturen führt zu Autophagosomen Bildung sind. Ein Protein von Interesse (POI) kann entweder mit einem roten oder cyan fluoreszierenden Marker markiert werden. Verschiedene Organellen, wie ER, Mitochondrien und Lysosomen, sind alle in verschiedenen Schritten Autophagosom Bildung beteiligt und können markiert mit einem bestimmten Farbstoff tracker werden. Zeitraffer-Mikroskopie autophagy in diesem experimentellen Aufbau, ermöglicht es, Informationen über die vierte Dimension, dh extrahiert werden. Daher können wir folgen den Beitrag des POI in Raum und Zeit Autophagie.

In das Protokoll beschrieben, haben wir Zeitraffer-Mikroskopie verwendet, um die Lokalisierung von GFP-markierten LC3 in einer Zelllinie folgen stabil exprimieren GFP-markierten DFCP1 unter Autophagie induzierenden Bedingungen. Das Ergebnis dieses Experiments ist die Einnahme von 2-Serie oder Stapel von Bildern, einer aus der grünen und einer aus dem blauen Kanal, entsprechend GFP-DFCP1 und CFP-LC3. Wir haben weiterhin diese Videos analysiert mit ImageJ, um Montagen entsprechend einzigen Autophagosom Bildung Veranstalt...

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Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Zeitraffer-Mikroskopie von fluoreszenzmarkierten Autophagie Marker erlaubt die Überwachung der dynamischen Autophagie Reaktion mit hoher zeitlicher Auflösung. Mit spezifischen Autophagie und Organellen Marker in einer Kombination aus 3 verschiedenen Farben, können wir folgen den Beitrag eines Proteins an Autophagosom Bildung in einem robusten räumlichen und zeitlichen Kontext.

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Research

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Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

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F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

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