Name: live cell imaging of early autophagy events: omegasomes and beyond
Uploaded: 2013-07-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond at JoVE.com

העבודה שלנו היא נתמכת על ידי ביוטכנולוגיה ו מחקר מדעי הביולוגיה המועצה. ברצוננו להודות לפרופ &#39;Tamotsu Yoshimori לחביבות לספק לנו עם פלסמיד לביטוי של CFP-LC3.

1. הכנת תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספר מעבר הנמוך של תאי זרע HEK-293T להביע ביציבות ה-GFP-DFCP1 על 22 מ&quot;מ coverslips עגול, תאי תרבות לילה בבינוני של Dulbecco הנשרים שונים (DMEM), לconfluency של 30-40% (למטרת confluency של 80% לאחר 2 ימים - יום של הדמיה תא חי). </li></ol><p class="jove_title" style="...

<ol>
	<li>Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+process+and+function.">Autophagy: process and function.</a> Genes Dev. 21, 2861-2873 (2007).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Atg+proteins+in+autophagosome+formation.">The role of Atg proteins in autophagosome formation.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27, 107-132 (2011).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+from+phenomenology+to+molecular+understanding+in+less+than+a+decade.">Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 931-937 (2007).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+revisited:+a+conversation+with+Christian+de+Duve.">Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve.</a> Autophagy. 4, 740-743 (2008).</li><li>Yla-Anttilba, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tomography+reveals+connections+between+the+phagophore+and+endoplasmic+reticulum.">3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum.</a> Autophagy. 5, 1180-1185 (2009).</li><li>Hayashi-Nishino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subdomain+of+the+endoplasmic+reticulum+forms+a+cradle+for+autophagosome+formation.">A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation.</a> Nat. Cell Biol. 11, 1433-1437 (2009).</li><li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+in+vivo+analyses+of+cell+function+using+fluorescence+imaging+(*).">Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*).</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 327-332 (2011).</li><li>Mizushima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+autophagosome+formation+using+Apg5-deficient+mouse+embryonic+stem+cells.">Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells.</a> The Journal of Cell Biology. 152, 657-668 (2001).</li><li>Itakura, E., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+autophagosome+formation+site+by+a+hierarchical+analysis+of+mammalian+Atg+proteins.">Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins.</a> Autophagy. 6, 764-776 (2010).</li><li>Axe, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosome+formation+from+membrane+compartments+enriched+in+phosphatidylinositol+3-phosphate+and+dynamically+connected+to+the+endoplasmic+reticulum.">Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum.</a> J Cell Biol. 182, 685-701 (2008).</li><li>Walker, S., Chandra, P., Manifava, M., Axe, E., Ktistakis, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+autophagosomes:+localized+synthesis+of+phosphatidylinositol+3-phosphate+holds+the+clue.">Making autophagosomes: localized synthesis of phosphatidylinositol 3-phosphate holds the clue.</a> Autophagy. 4, 1093-1096 (2008).</li></ol>

השיטה שתוארה בפרוטוקול זה מאפשרת הדמיה של הלוקליזציה של חלבון במהלך היווצרות autophagosome. יש לנו ניסינו שיטות שונות של לדמיין את האירועים מתוארים בי-סריקת נקודת confocal, ספינינג confocal דיסק וקרינת השתקפות הכל (TIRF) מיקרוסקופיה. מצאנו כי למטרות כלליות סטנדרטית עלית הקרינה רחבה ...

Autophagy היא תהליך דינמי מאוד, שמצריך תיאום בין מספר רב של חלבונים לתוצאה הסופית של היווצרות autophagosome 1-3. מיקרוסקופית הוא כנראה הטכניקה מיושמת בדרך כלל ללימוד autophagy 4. הלוקליזציה של רוב חלבוני autophagy, נחקרה בהרחבה בתאים קבועים, הן על ידי חיסוני מכתים-החלבונים אנדוגניים ועל ידי ביטוי של חלבון אקסוגני מתויג fluorescently. בנוסף, מיקרוסקופית אלקטרונים (EM), לבד ובשילוב עם תיוג חיסוני זהב, תאר את הפרטים הקטנים של מבנים אלה 5,6. למרות העובדה שטכניקות אלה הקימו את ההבנה של היווצרות autophagosome ב 3 הממדים של החלל שלנו, הם לא הצליחו לספק כמות מספקת של מידע על ממד ה 4 - זמן. הדמיה תא חי מתגברת על המכשול הזה כפי שהוא מאפשר לאחר היווצרות autophagosome הקרוב ככל possi כble לזמן אמת 7. טכניקה זו הועסקה ראשונה ללמוד autophagy ידי Yoshimori ועמיתים 8, וכבר בשימוש יותר ויותר מעתה ואילך. מיקרוסקופיה זמן לשגות לוכדת את הלוקליזציה של נקודות עניין בתאים חיים ועל פני תקופה של זמן. על ידי השוואת מידע זה עם autophagy ו / או אברון סמן מאופיינים היטב, ניתוח הדמיה תא חי יכול לשים את נקודת העניין בהקשר המרחב ובזמן גדול יותר של היווצרות autophagosome. ניתוח הדמיה תא חי מבוסס על הלכידה החוזרת ונשנית של לוקליזציה POI לאורך כל השלבים של היווצרות autophagosome, תוך הדמיה של תאים קבועים מבוססת על לכידה אחת. לכן, הדמיה תא חי יכולה להוכיח את התרומה של נקודות עניין בשלבים מסוימים של היווצרות autophagosome, תוך הדמיה של תאים קבועים יכולה רק להניח את התפקיד של נקודות עניין, המבוסס על הלוקליזציה הממוצעת שלה בautophagosomes רבים שנתפסו בו זמנית בשלבים שונים שלהם lifecyCLE. למרות שהדמית תא חי היא שיטה של ​​כוח האנליטי גבוה, יש לו כמה מגבלות מובנות, שיש להביאם בחשבון. קודם כל, הדמיה תא חי דורשת את הביטוי של אחד או יותר מחלבונים שכותרתו fluorescently אקסוגניים. תגי ניאון נוטים להיות גדול בגודל ולפעמים הם יכולים לשנות את ההתנהגות של חלבון בשל סיבות סטריות. מצב זה מודגש לחלבונים בממברנה, כפי שהם צריכים כדי לתפקד במרחב המוגבל של 2 ממדים של ממברנות. ראוי לציין, autophagosomes הם מבנים קרומיים, ובהתאם להיווצרותם דורשת מספר רב של חלבוני קרום הקשורים. קבוצה נוספת של בעיות קשורה לרמות הביטוי של נקודות עניין. באופן עקרוני, צריך לבוא לידי ביטוי חלבון אקסוגני ברמות דומות לחלבון אנדוגני. הדבר מבטיח כי רגולטורים חשובים של לוקליזציה משנה הסלולר שלו לא רוויים, והניתוח דואר יהיה רלוונטי מבחינה ביולוגית. יתר על כן, יש להימנע מביטוי יתר של חלבוני autophagy, כפי שהם באים לידי ביטוי כאשר מעל הרמות אנדוגניים, הם נוטים לדכא את תגובת autophagy 9. לעומת זאת, מאחר שרמות הביטוי של נקודת העניין צריך להיות גבוה מספיק כדי לאפשר ביצוע הלוקליזציה שלה לתקופה טובה של זמן בלי תמונה הלבנת-, יש פשרה שהושגה. רמות הביטוי האופטימליות של חלבון בתאי אקסוגני mammalians השגת דורשת הרבה כוונון עדין, אבל זה אפשרי על ידי ההקמה וסינון שורות תאים ביציבות להביע רמות של נקודות עניין שונות. הרזולוציה מרחבית שניתן להשיג עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הסטנדרטי היא עוד גורם מגביל. ההחלטה עשויה להיות מוגבלת למספר הסיבות, אבל במקרה טוב, ברזולוציה רוחב תהיה סביב 250 ננומטר. משמעות דבר היא כי כל החפץ מופרד על ידי מרחק קטן יותר מזה יופיע מחובר (או כאחתאובייקט) ואובייקטים קטנים מ -250 ננומטר יהיו מיוצגים בתמונה הגדולה יותר ממה שהם באמת. לכן תמונות צריכים תמיד לפרש עם זה בחשבון וטכניקות משלימות כגון EM תידרש לפתור בפירוט אולטרה מבני בסדר. לבסוף, הדמיה תא חי מטבעו דורשת חשיפת תא לאור, שעלול להיות לתקופה ממושכת של זמן. זה עשוי לשנות את התגובות הפיזיולוגיות של תא, תופעה הידועה בצילום רעילות. אנחנו השתמשנו בהצלחה הדמיה תא חי של חלבון PI3P מחייב DFCP1 לתאר בפעם הראשונה שautophagosomes מקורן מבני PI3P עשירים דמויי טבעת omegasomes כינה, הנמצאים בקשר הדוק עם חדר מיון גדילים 10,11. באופן ברור יש לנו הראינו כי מבני LC3 חיוביים להתחיל להרכיב בשיתוף הדוק עם omegasomes. אנחנו כאן מצביעים על כך שהעסקת שורת תאים להביע GFP-DFCP1 יציבות לתא החיהדמיה של החלבון של עניין, קובעת מסגרת מרחב ובזמן חזקה לאפיון של תפקידה בהיווצרות autophagosome.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>OptiMEM I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-062</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MitoTracker Red FM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M22425</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LysoTracker Red DND-99</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L-7528</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>22 mm coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0159</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm plates</td>
			<td>Fisher NUNC</td>
			<td>153066</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Silicon grease</td>
			<td>RS Components Ltd. </td>
			<td>RS 494-124</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>O-rings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-7816</td>
			<td>Suggested alternative to custom-made O-rings</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO 100XO</td>
			<td>N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA-R2 C10600 10B</td>
			<td>Progressive scan interline CCD</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Illuminator</td>
			<td>TILL Photonics</td>
			<td>Polychrome V</td>
			<td>Ultrafast monochromator</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Incubation chamber</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td>Cell^R IX81</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SIS xcellence</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

live cell imaging of early autophagy events: omegasomes and beyond

Autophagy היא תגובה תאית מופעלת על ידי חוסר של חומרים מזינים, במיוחד היעדרות של חומצות אמינו. Autophagy מוגדרת על ידי היווצרות של מבני קרום כפולים, שנקראה autophagosomes, שלעקל חלבוני ציטופלסמה, חיים ארוכים ואגרגטים חלבון, אברונים פגומים, ואפילו וירוסים או חיידקים. Autophagosomes סופו של דבר להתמזג עם lysosomes המוביל לזילות עיקר התוכן שלהם, עם החומרים המזינים המיוצרים להיות ממוחזרים חזרה לציטופלסמה. לכן, autophagy היא חיונית לאיזון תא, וdysregulation של autophagy יכול להוביל למחלות, בעיקר ניוון מוחיים, הזדקנות וסרטן. היווצרות Autophagosome היא תהליך מאוד מורכב, שבו תאים להקצו לקבוצה מסוימת של חלבונים, הנקראת מכונות autophagy ליבה. מכונות autophagy הליבה היא השלימה תפקודית על ידי חלבונים נוספים הכרוכות בתהליכים תאיים שונים, למשל בmembranסחר בדואר, בביולוגיה של המיטוכונדריה וlysosomal. תיאום של החלבונים הללו ליצירת והשפלה של autophagosomes מהווה תגובה הדינמית והמתוחכמת ביותר של autophagy. הדמיה תא חי מאפשרת לעקוב אחר התרומה המולקולרית של כל חלבון הקשור לautophagy עד לרמה של אירוע היווצרות autophagosome אחת ובזמן אמת, ולכן טכניקה זו מציעה רזולוציה גבוהה של זמן ומרחב. כאן אנו משתמשים שורת תאים ביציבות להביע GFP-DFCP1, להקים הקשר מרחב ובזמן לניתוח שלנו. DFCP1 omegasomes סימנים, שהם מבנים מבשר מובילים להיווצרות autophagosomes. חלבון של עניין (POI) יכול להיות מסומן עם או אדום או תג ניאון ציאן. אברונים שונים, כמו ER, מיטוכונדריה וlysosomes, כולם מעורבים בשלבים של היווצרות autophagosome שונים, ויכולים להיות מסומן באמצעות צבע גשש ספציפי. מיקרוסקופיה זמן לשגות של autophagy בסט את הניסוי הזה, מאפשר למידע להיות מופק על הממד הרביעי, כלומר הזמן. מכאן אנו יכולים לעקוב אחר התרומה של POI לautophagy במרחב ובזמן.

בפרוטוקול מתואר, השתמשנו מיקרוסקופיה זמן לשגות לעקוב הלוקליזציה של LC3 CFP מתויג בשורת תאים ביציבות להביע DFCP1 GFP-tagged, בתנאים ישכנעו autophagy. התוצאה של ניסוי זה היא לכידתו של 2 סדרה או ערימות של תמונות, אחד מירוק ואחת מהערוץ הכחול, מתאימות לGFP-DFCP1 וCFP-LC3. יש לנו עוד ניתחו את סרטי ...

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond at JoVE.com

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

מיקרוסקופיה זמן לשגות של סמני autophagy כותרתו fluorescently מאפשרת ניטור של תגובת autophagy הדינמית עם רזולוציה גבוהה זמנית. שימוש autophagy ספציפית וסמני אברון בשילוב של 3 צבעים שונים, אנו יכולים לעקוב אחר תרומתו של חלבון להיווצרות autophagosome בהקשר מרחב ובזמן חזק.

לחיות תא הדמיה של אירועי autophagy מוקדמים: Omegasomes ומעבר

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

סריג מיקרוסקופי לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות Biosensors Unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנ&quot;א

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

הפעלת Autophagy ידי פעילות גופנית אירובית בעכברים

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

אפיון של אירועים קלציפיקציה שימוש אופטי חיה מיקרוסקופית אלקטרונים טכניקות בתוך ימית תולעת-שפופרת

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Live-cell הדמיה של degranulation טסיות והפרשה תחת זרימה

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

יישום של ממברנה וקיר תא צבעי פלורסנט סלקטיבית עבור הדמיה בשידור חי התא של פטריות Filamentous

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

הדמיית תאים חיים ברזולוציה סופר-רזולוציה של מבנים תת-תאיים

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...