Name: live cell imaging of early autophagy events: omegasomes and beyond
Uploaded: 2013-07-27T14:00:00
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Il nostro lavoro è supportato dal Biotecnologie e Scienze Biologiche Research Council. Vorremmo ringraziare il Prof Tamotsu Yoshimori per la gentile fornitura di noi con il plasmide per l&#39;espressione di CFP-LC3.

1. Preparazione delle cellule <ol><li> Seme basso numero di cellule HEK passaggio-293T esprimono stabilmente GFP-DFCP1 on 22 millimetri coprioggetto arrotondato; cellule di coltura durante la notte in mezzo di Dulbecco Modified Eagles (DMEM), ad una confluenza del 30-40% (obiettivo per una confluenza del 80% dopo 2 giorni - giorno di imaging cellulare dal vivo). </li></ol> 2. Trasfezione delle cellule <ol><li> Preparare la trasfezione complesso mix per ogni piastra, contenente 100 ml OptiMEM ...

<ol>
	<li>Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+process+and+function.">Autophagy: process and function.</a> Genes Dev. 21, 2861-2873 (2007).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Atg+proteins+in+autophagosome+formation.">The role of Atg proteins in autophagosome formation.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27, 107-132 (2011).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+from+phenomenology+to+molecular+understanding+in+less+than+a+decade.">Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 931-937 (2007).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+revisited:+a+conversation+with+Christian+de+Duve.">Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve.</a> Autophagy. 4, 740-743 (2008).</li><li>Yla-Anttilba, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tomography+reveals+connections+between+the+phagophore+and+endoplasmic+reticulum.">3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum.</a> Autophagy. 5, 1180-1185 (2009).</li><li>Hayashi-Nishino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subdomain+of+the+endoplasmic+reticulum+forms+a+cradle+for+autophagosome+formation.">A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation.</a> Nat. Cell Biol. 11, 1433-1437 (2009).</li><li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+in+vivo+analyses+of+cell+function+using+fluorescence+imaging+(*).">Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*).</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 327-332 (2011).</li><li>Mizushima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+autophagosome+formation+using+Apg5-deficient+mouse+embryonic+stem+cells.">Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells.</a> The Journal of Cell Biology. 152, 657-668 (2001).</li><li>Itakura, E., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+autophagosome+formation+site+by+a+hierarchical+analysis+of+mammalian+Atg+proteins.">Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins.</a> Autophagy. 6, 764-776 (2010).</li><li>Axe, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosome+formation+from+membrane+compartments+enriched+in+phosphatidylinositol+3-phosphate+and+dynamically+connected+to+the+endoplasmic+reticulum.">Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum.</a> J Cell Biol. 182, 685-701 (2008).</li><li>Walker, S., Chandra, P., Manifava, M., Axe, E., Ktistakis, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+autophagosomes:+localized+synthesis+of+phosphatidylinositol+3-phosphate+holds+the+clue.">Making autophagosomes: localized synthesis of phosphatidylinositol 3-phosphate holds the clue.</a> Autophagy. 4, 1093-1096 (2008).</li></ol>

Il metodo descritto in questo protocollo permette la visualizzazione di localizzazione di una proteina durante la formazione dell&#39;autofagosoma. Abbiamo provato vari metodi per visualizzare gli eventi descritti anche da punto di scansione confocale, spinning disk confocale e Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopia. Abbiamo trovato che per scopi generali standard wide-field epi-fluorescenza fornisce il miglior compromesso tra sensibilità e risoluzione. Questo assicura buon segnale al rumore, photo-b...

Autofagia è un processo altamente dinamico, che richiede il coordinamento di un gran numero di proteine ​​per l&#39;esito finale della formazione dell&#39;autofagosoma 1-3. Microscopia è probabilmente la tecnica più comunemente applicato per studiare l&#39;autofagia 4. La localizzazione della maggior parte delle proteine ​​autofagia è stata ampiamente studiata in cellule fisse, sia mediante immuno-colorazione, le proteine ​​endogene e dalla espressione della proteina esogena fluorescente tag. Inoltre, la microscopia elettronica (EM), da solo e in combinazione con etichettatura immuno-oro, ha descritto i dettagli particolari di queste strutture 5,6. Nonostante il fatto che queste tecniche hanno stabilito la nostra comprensione della formazione dell&#39;autofagosoma nelle tre dimensioni dello spazio, non sono riusciti a fornire sufficiente quantità di informazioni sulla 4 ° dimensione - tempo. Imaging dal vivo cella supera questa barriera quanto consente seguito alla formazione di un dell&#39;autofagosoma il più vicino possisibile tempo reale 7. Questa tecnica è stato impiegato per studiare l&#39;autofagia da Yoshimori e colleghi 8, ed è stato sempre più utilizzato d&#39;ora in poi. Microscopia time-lapse cattura la localizzazione del PDI in cellule vive e per un periodo di tempo. Confrontando questi dati con una autofagia ben caratterizzato e / o organelli marcatore, analisi imaging cellulare dal vivo può mettere il POI nel più ampio contesto spaziale e temporale della formazione autofagosoma. Analisi imaging dal vivo cella è basato sulla cattura ripetitiva della localizzazione PDI lungo tutte le fasi di formazione autofagosoma, mentre l&#39;imaging di cellule fissate si basa su una singola acquisizione. Pertanto, l&#39;imaging cellulare dal vivo in grado di dimostrare il contributo del POI in fasi specifiche di formazione autofagosoma, mentre l&#39;imaging di cellule fisse può assumere solo il ruolo di punti di interesse, in base alla sua localizzazione media in molti autophagosomes catturate simultaneamente in diverse fasi della loro lifecyCLE. Sebbene l&#39;imaging cellulare dal vivo è un metodo di alta potenza analitica, ha alcune limitazioni intrinseche, che dovrebbero essere presi in considerazione. Prima di tutto, di cellule vive richiede l&#39;espressione di una o più proteine ​​esogene fluorescente. Tag fluorescenti tendono ad essere di grandi dimensioni e che a volte possono alterare il comportamento di una proteina per ragioni steriche. Questa situazione è accentuata per proteine ​​di membrana, poichè devono funzionare nello spazio limitato delle dimensioni di 2 membrane. Di nota, autophagosomes sono strutture membranose, e di conseguenza la loro formazione richiede un gran numero di proteine ​​associate alla membrana. Un&#39;altra serie di problemi è collegata ai livelli di espressione di POI. In linea di principio, una proteina esogena dovrebbe essere espressa a livelli comparabili alla proteina endogena. Questo assicura che importanti regolatori della sua localizzazione sub-cellulare non saranno saturati, e THanalisi e sarà biologicamente rilevanti. Inoltre, la sovraespressione di proteine ​​autofagia dovrebbe essere evitato, come quando sono espresse sopra dei livelli endogeni, tendono a inibire la risposta autofagia 9. Viceversa, poiché i livelli di espressione della PDI dovrebbe essere sufficientemente alta da permettere successivo alla localizzazione per un buon periodo di tempo senza fotometabolismo, un compromesso deve essere raggiunto. Raggiungere i livelli di espressione ottimali di una proteina esogena in cellule di mammiferi richiede un sacco di messa a punto, ma è fattibile attraverso la definizione e lo screening di linee cellulari che esprimono stabilmente diversi livelli del POI. La risoluzione spaziale che si può ottenere con un microscopio a fluorescenza è un altro fattore limitante. Risoluzione può essere limitata per una serie di ragioni, ma nella migliore risoluzione laterale sarà di circa 250 nm. Ciò significa che gli eventuali oggetti separati da una distanza inferiore a questo appariranno collegato (o come singolaoggetto) e gli oggetti di dimensioni inferiori a 250 nm saranno rappresentati nell&#39;immagine più grande di quello che realmente sono. Quindi le immagini devono essere sempre interpretati con questo in mente e tecniche complementari come EM sarà richiesto di risolvere piccoli dettagli ultra-strutturale. Infine, di cellule vive richiede intrinsecamente esponendo una cella alla luce, potenzialmente per un periodo prolungato di tempo. Ciò può alterare le risposte fisiologiche di una cellula, un fenomeno noto come foto-tossicità. Abbiamo utilizzato con successo l&#39;imaging cellulare dal vivo della proteina PI3P vincolante DFCP1 a descrivere per la prima volta che autophagosomes provengono da PI3P ricchi di strutture anulari omegasomes chiamati, che sono in stretta associazione con ER filoni 10,11. Abbiamo chiaramente dimostrato che le strutture LC3-positivi cominciano a formare in stretta associazione con omegasomes. Noi qui suggeriamo che impiegando una linea cellulare che esprime stabilmente GFP-DFCP1 per la cella vivoImaging della proteina di interesse, stabilisce un quadro spaziale e temporale robusto per la caratterizzazione del suo ruolo nella formazione dell&#39;autofagosoma.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>OptiMEM I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-062</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MitoTracker Red FM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M22425</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LysoTracker Red DND-99</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L-7528</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>22 mm coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0159</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm plates</td>
			<td>Fisher NUNC</td>
			<td>153066</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Silicon grease</td>
			<td>RS Components Ltd. </td>
			<td>RS 494-124</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>O-rings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-7816</td>
			<td>Suggested alternative to custom-made O-rings</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO 100XO</td>
			<td>N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA-R2 C10600 10B</td>
			<td>Progressive scan interline CCD</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Illuminator</td>
			<td>TILL Photonics</td>
			<td>Polychrome V</td>
			<td>Ultrafast monochromator</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Incubation chamber</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td>Cell^R IX81</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SIS xcellence</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

live cell imaging of early autophagy events: omegasomes and beyond

Autofagia è una risposta cellulare innescata dalla mancanza di nutrienti, in particolare l&#39;assenza di amminoacidi. L&#39;autofagia è definita dalla formazione di strutture a doppia membrana, chiamata autophagosomes, che sequestrare il citoplasma, proteine ​​longevi e aggregati proteici, organelli difettosi, e anche virus o batteri. Autophagosomes alla fine si fondono con i lisosomi che portano alla degradazione grosso del loro contenuto, con le sostanze nutritive prodotte essere riciclati al citoplasma. Pertanto, l&#39;autofagia è fondamentale per l&#39;omeostasi cellulare, e la disregolazione di autofagia può portare a malattie, in particolare neurodegenerazione, l&#39;invecchiamento e il cancro. Formazione dell&#39;autofagosoma è un processo molto elaborato, per cui le cellule hanno assegnato un gruppo specifico di proteine, chiamato il macchinario nucleo autofagia. Il macchinario nucleo autofagia è funzionalmente integrata da proteine ​​addizionali coinvolti in diversi processi cellulari, ad esempio in membrane il traffico, nella biologia dei mitocondri e lisosomi. Il coordinamento di queste proteine ​​per la formazione e la degradazione del autophagosomes costituisce la risposta altamente dinamico e sofisticato di autofagia. Imaging dal vivo cella permette di seguire il contributo molecolare di ogni proteina autofagia correlata al livello di un singolo evento formazione dell&#39;autofagosoma ed in tempo reale, pertanto questa tecnica offre un&#39;alta risoluzione temporale e spaziale. Qui usiamo una linea di cellule che esprimono stabilmente GFP-DFCP1, per stabilire un contesto spaziale e temporale per la nostra analisi. DFCP1 marchi omegasomes, che sono strutture di precursori che portano alla formazione autophagosomes. Una proteina di interesse (POI) può essere contrassegnato con un rosso o un tag fluorescente ciano. Diversi organelli, come ER, mitocondri ed i lisosomi, sono tutti coinvolti nelle diverse fasi di formazione autofagosoma, e possono essere contrassegnati con un colorante specifico inseguitore. Time-lapse microscopia di AutopHagy in questo set up sperimentale, consente alle informazioni di essere estratto per la quarta dimensione, cioè il tempo. Quindi siamo in grado di seguire il contributo del PDI di autofagia nello spazio e nel tempo.

Nel protocollo descritto, abbiamo usato la microscopia time-lapse di seguire la localizzazione di CFP-tag LC3 in una linea di cellule che esprimono stabilmente GFP-tagged DFCP1, in condizioni che inducono autofagia. Il risultato di questo esperimento è la cattura di serie 2 o pile di immagini, uno dal verde e uno del canale blu, corrispondenti a GFP-DFCP1 e CFP-LC3. Abbiamo inoltre analizzato questi video usando ImageJ, al fine di creare montaggi corrispondenti ad eventi di formazione autofagosoma singoli, come descrit...

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Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Time-lapse microscopia di marcatori autofagia fluorescente permette il monitoraggio della risposta autofagia dinamica con alta risoluzione temporale. Utilizzando l&#39;autofagia specifico e marcatori di organelli in una combinazione di 3 colori diversi, siamo in grado di seguire il contributo di una proteina di formazione dell&#39;autofagosoma in un contesto spaziale e temporale robusto.

Imaging cellulare dal vivo dei primi autofagia Eventi: Omegasomes e oltre

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