Name: live cell imaging of early autophagy events: omegasomes and beyond
Uploaded: 2013-07-27T14:00:00
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우리의 연구는 생물 공학 및 생물 과학 연구위원회에 의해 지원됩니다. 우리는 친절 CFP-LC3의 발현 플라스미드으로 우리를 공급하기위한 교수 길이 요시모리에게 감사의 말씀을 전합니다.

1. 세포의 준비 <ol><li> (2 후 80 %의 confluency에 대한 목표 30-40%의 자랄 때에, Dulbecco 수정 이글스의 중간 (DMEM)에서 하룻밤 배양 세포, HEK - 293T 세포의 씨앗 낮은 통로 번호가 안정적으로 22mm 라운드의 coverslips에 GFP-DFCP1을 표현 일 - 라이브 셀 이미징 일). </li></ol> 2. 세포 형질 <ol><li> 나는 혈청 배지, 3 μL X-tremeGENE 9 DNA의 형질 시약 및 pECFP-LC3 플라스미드 DNA 0.5 μg을 감소 100 μL OptiMEM을...

<ol>
	<li>Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+process+and+function.">Autophagy: process and function.</a> Genes Dev. 21, 2861-2873 (2007).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Atg+proteins+in+autophagosome+formation.">The role of Atg proteins in autophagosome formation.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27, 107-132 (2011).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+from+phenomenology+to+molecular+understanding+in+less+than+a+decade.">Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 931-937 (2007).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+revisited:+a+conversation+with+Christian+de+Duve.">Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve.</a> Autophagy. 4, 740-743 (2008).</li><li>Yla-Anttilba, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tomography+reveals+connections+between+the+phagophore+and+endoplasmic+reticulum.">3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum.</a> Autophagy. 5, 1180-1185 (2009).</li><li>Hayashi-Nishino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subdomain+of+the+endoplasmic+reticulum+forms+a+cradle+for+autophagosome+formation.">A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation.</a> Nat. Cell Biol. 11, 1433-1437 (2009).</li><li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+in+vivo+analyses+of+cell+function+using+fluorescence+imaging+(*).">Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*).</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 327-332 (2011).</li><li>Mizushima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+autophagosome+formation+using+Apg5-deficient+mouse+embryonic+stem+cells.">Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells.</a> The Journal of Cell Biology. 152, 657-668 (2001).</li><li>Itakura, E., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+autophagosome+formation+site+by+a+hierarchical+analysis+of+mammalian+Atg+proteins.">Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins.</a> Autophagy. 6, 764-776 (2010).</li><li>Axe, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosome+formation+from+membrane+compartments+enriched+in+phosphatidylinositol+3-phosphate+and+dynamically+connected+to+the+endoplasmic+reticulum.">Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum.</a> J Cell Biol. 182, 685-701 (2008).</li><li>Walker, S., Chandra, P., Manifava, M., Axe, E., Ktistakis, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+autophagosomes:+localized+synthesis+of+phosphatidylinositol+3-phosphate+holds+the+clue.">Making autophagosomes: localized synthesis of phosphatidylinositol 3-phosphate holds the clue.</a> Autophagy. 4, 1093-1096 (2008).</li></ol>

이 프로토콜에서 설명하는 방법은 autophagosome 형성하는 동안 단백질의 지방화 시각화 할 수 있습니다. 우리는 이벤트 디스크 공 촛점과 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 회전, 포인트 스캐닝 공 촛점을 포함한 기술 시각화하는 다양한 방법을 시도했다. 우리는 일반적인 목적을 위해 표준 넓은 분야 에피 형광 감도와 해상도 사이의 최고의 타협을 제공하는 것으로 나타났습니다. 이 잡음을 최소화 pho...

autophagy에 1-3 autophagosome 형성의 최종 결과에 대한 단백질의 다수의 조정을 필요로하는 매우 역동적 인 과정이다. 현미경은 아마도 가장 일반적으로 autophagy에 4 공부에 적용하는 기술이다. 대부분의 자식 작용 단백질의 지방화는 광범위하게 모두 내생 단백질을 면역 염색 및 형광 태그 외인성 단백질의 표현으로, 고정 세포에서 연구되어왔다. 또한, 전자 현미경 (EM), 혼자 면역 골드 라벨,와 함께 이러한 구조 5,6의 정밀한 세부 사항을 설명하고있다. 시간 -이 기술은 공간의 3 차원 autophagosome 형성에 대한 우리의 이해를 설립 있다는 사실에도 불구하고, 그들은 4 번째 차원에 대한 정보의 충분한 양을 제공하는 데 실패했다. 이 possi 가까이로 autophagosome의 형성에 따라 허용하는 라이브 셀 이미징이 장벽을 극복실시간 7 BLE. 이 기술은 처음 요시모리와 동료 8로 자식 작용을 연구하기 위해 사용되었고, 점점 이제부터 사용되었습니다. 시간 경과 현미경은 살아있는 세포에서 POI의 시간의 기간 동안 현지화를 캡처합니다. 잘 특성화 자식 작용 및 / 또는 세포 소기관 마커로이 정보를 비교하여 라이브 셀 이미징 분석 autophagosome 형성의 큰 공간과 시간적 맥락에서 POI를 넣을 수 있습니다. 라이브 셀 이미징 분석 autophagosome 형성의 단계에 따라 POI 현지화의 반복적 캡처를 기반으로 고정 된 세포의 이미지가 하나의 캡처를 기반으로하는 동안.에게 고정 된 세포의 영상은 그들의 생명주기의 다른 단계에서 동시에 캡처 한 여러 autophagosomes에서의 평균 현지화에 기반 POI의 역할을 가정 할 수있는 동안 따라서, 라이브 셀 이미징, autophagosome 형성의 특정 단계에서 POI의 기여를 입증 할 수CLE. 라이브 셀 이미징 높은 분석력하는 방법이지만, 그것은 고려되어야 할 몇 가지 본질적인 한계를 가지고 있습니다. 첫째로 모두의, 라이브 셀 이미징은 하나 이상의 외래 찬란 단백질의 발현을 필요로합니다. 형광 태그의 크기가 큰 경향이 있으며 때로는 입체 이유로 단백질의 동작을 변경할 수 있습니다. 그들이 막 2 차원의 제한된 공간에서 작동하는 데 필요한만큼이 상황은, 막 단백질에 대한 강조된다. 참고로, autophagosomes는 막 구조이며, 그에 따라 형성 막 관련 단백질의 다수를 필요로합니다. 문제의 또 다른 세트는 POI의 발현 수준에 연결됩니다. 원칙적으로, 외인성 단백질은 내인성 단백질에 비해 수준에서 표현되어야한다. 이 하위 세포 지방화의 중요한 규제가 포화되지 않도록 보장하며, 일전자 분석은 생물학적으로 관련이있을 것입니다. 그들은 내생 수준 위에 표현 될 때, 그들은 autophagy에 응답 9을 억제하는 경향 또한, 자식 작용 단백질의 과발현은 피해야한다. 반대로, POI의 발현 이후 사진 표백하지 않고 시간의 좋은 기간에 대한 지역화에 따라 수 있도록 충분히 높아야한다, 타협에 도달 할 수있다. mammalians 세포에서 외인성 단백질의 최적 발현 수준을 달성하는 것은 미세 조정이 많이 필요하지만 안정적으로 POI의 다른 수준을 표현하는 세포 라인을 확립하고 심사에 의해 가능한 것입니다. 표준 형광 현미경으로 얻을 수있는 공간 해상도는 또 다른 제한 요인이다. 해상도는 이유로 제한 될 수 있습니다,하지만 기껏 수평 해상도는 250 nm의 주위에있을 것입니다. 이것은이보다 작은 거리로 구분하는 개체 (또는 단일로 연결 표시된다는 것을 의미합니다개체)와 250 nm의보다 작은 개체가 실제로보다 큰 이미지로 표현됩니다. 따라서 이미지는 항상 염두에두고 해석해야하고 EM 등의 보완 기술은 미세 매우 구조적 세부 사항을 확인해야합니다. 마지막으로, 라이브 셀 이미징은 본질적으로 오랜 기간 동안 잠재적으로, 빛에 세포를 노출해야합니다. 이 세포 사진 독성으로 알려진 현상​​의 생리적 반응을 변경할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 autophagosomes는 ER 가닥 10,11과 밀접한 관계에있다 PI3P 풍부한 고리 같은 구조라고 omegasomes에서 발생하는 첫 번째 시간을 설명하는 PI3P 결합 단백질 DFCP1의 라이브 셀 이미징을 사용했습니다. 우리는 명확하게 LC3 양성 구조 omegasomes와 긴밀한 관계 형성을 시작하는 것으로 나타났습니다. 우리는 여기서 세포 라인을 채택하는 것은 안정적으로 라이브 셀 GFP-DFCP1을 표현하는 것이 좋습니다관심의 단백질의 영상은, autophagosome 형성에 역할의 특성에 대한 강력한 공간과 시간 프레임을 설정합니다.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>OptiMEM I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-062</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MitoTracker Red FM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M22425</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LysoTracker Red DND-99</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L-7528</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>22 mm coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0159</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm plates</td>
			<td>Fisher NUNC</td>
			<td>153066</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Silicon grease</td>
			<td>RS Components Ltd. </td>
			<td>RS 494-124</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>O-rings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-7816</td>
			<td>Suggested alternative to custom-made O-rings</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO 100XO</td>
			<td>N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA-R2 C10600 10B</td>
			<td>Progressive scan interline CCD</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Illuminator</td>
			<td>TILL Photonics</td>
			<td>Polychrome V</td>
			<td>Ultrafast monochromator</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Incubation chamber</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td>Cell^R IX81</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SIS xcellence</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

live cell imaging of early autophagy events: omegasomes and beyond

autophagy에 특히 영양소, 아미노산의 부재의 부족에 의해 발생 세포 반응이다. 자식 작용은 세포질, 수명이 긴 단백질도 단백질 집계, 결함이있는 세포 소기관, 바이러스 또는 박테리아를 격리 할 autophagosomes라는 이중 막 구조의 형성에 의해 정의됩니다. Autophagosomes 결국 생성 된 영양소가 세포질로 재활용되고 함께 자신의 콘텐츠를 대량으로 저하로 이어지는 리소좀과 융합. 따라서 자식 작용은 세포의 항상성을 위해 중요하고, 자식 작용의 조절 장애는 질병, 특히 신경 변성, 노화 및 암으로 이어질 수 있습니다. Autophagosome 형성 세포가 핵심 autophagy에 기계라는 단백질의 특정 그룹을 할당 한되는, 매우 정교한 과정이다. 핵심 autophagy에 기계는 기능, 다양한 세포 과정에 관여 추가적인 단백질에 의해 보완 membran의 예입니다미토콘드리아와 리소좀 생물학 전자 매매. autophagosomes의 형성과 분해 이러한 단백질의 조정은 자식 작용의 매우 역동적이고 정교한 응답을 구성합니다. 라이브 셀 이미징 하나 하나 autophagosome 대형 이벤트의 수준으로 각 autophagy에 관련된 단백질의 분자 기여를 따라 할 수 있으며 실시간 따라서이 기술은 높은 공간적 해상도를 제공합니다. 여기에서 우리는 우리의 분석을위한 공간적 컨텍스트를 설정하기 위해, 안정적으로 GFP-DFCP1을 표현하는 세포 라인을 사용합니다. autophagosomes 형성에 선도적 인 전구체 구조입니다 DFCP1 마크 omegasomes. 관심 (POI)의 단백질은 적색 또는 청록색 형광 태그 하나와 함께 표시 할 수 있습니다. 미토콘드리아와 리소좀 ER 같은 다른 세포 소기관은, 모든 autophagosome 형성의 여러 단계에 관여하고 있으며, 특정 추적기 염료를 사용하여 표시 할 수 있습니다. AUTOP의 경과 현미경이 실험 세트 업의 hagy이 정보는 4 차원, 즉 시간에 대한 추출 할 수 있습니다. 따라서 우리는 공간과 시간에서 자식 작용하는 POI의 기여를 볼 수 있습니다.

프로토콜이 설명에서 우리는 안정적으로 autophagy를 유도 조건 하에서 GFP - 태그 DFCP1을 표현하는 세포 라인 CFP-태그 LC3의 국산화를 따라 시간 경과 현미경을 사용했습니다. 이 실험의 결과는 2 시리즈 또는 GFP-DFCP1와 CFP-LC3에 해당하는 이미지, 녹색에서 하나 파랑 채널에서 하나의 스택의 캡처입니다. 우리는 더 이상 같은 프로토콜 절에 설명 된 단일 autophagosome 대형 이벤트에 해당 몽타주를 작성하?...

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Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

찬란 autophagy에 마커의 시간 경과 현미경은 높은 시간적 해상도로 동적 autophagy에 응답을 모니터링 할 수 있습니다. 3 가지 색상의 조합으로 특정 자식 작용과 세포 기관 마커를 사용하여, 우리는 강력한 공간과 시간적 맥락에서 autophagosome 형성 단백질의 기여를 볼 수 있습니다.

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