Name: live cell imaging of early autophagy events: omegasomes and beyond
Uploaded: 2013-07-27T14:00:00
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Nosso trabalho é apoiado pelo Conselho de Pesquisa em Biotecnologia e Ciências Biológicas. Gostaríamos de agradecer a Prof Tamotsu Yoshimori para gentilmente nos fornecer com o plasmídeo para a expressão da CFP-LC3.

1. Preparação celular <ol><li> Semente de baixo número de passagem das células HEK-293T que expressam estavelmente GFP DFCP1 em 22 lamelas redondas mm; células de cultura durante a noite em Meio de Eagles Modificado por Dulbecco (DMEM), a uma confluência de 30-40% (o objectivo de confluência de 80% após 2 dias - dias de imagens de células vivas). </li></ol> 2. Transfecção celular <ol><li> Prepare a mistura complexa de transfecção para cada prato, contendo 100 mL OptiMEM eu reduzi...

<ol>
	<li>Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+process+and+function.">Autophagy: process and function.</a> Genes Dev. 21, 2861-2873 (2007).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Atg+proteins+in+autophagosome+formation.">The role of Atg proteins in autophagosome formation.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27, 107-132 (2011).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+from+phenomenology+to+molecular+understanding+in+less+than+a+decade.">Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 931-937 (2007).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+revisited:+a+conversation+with+Christian+de+Duve.">Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve.</a> Autophagy. 4, 740-743 (2008).</li><li>Yla-Anttilba, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tomography+reveals+connections+between+the+phagophore+and+endoplasmic+reticulum.">3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum.</a> Autophagy. 5, 1180-1185 (2009).</li><li>Hayashi-Nishino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subdomain+of+the+endoplasmic+reticulum+forms+a+cradle+for+autophagosome+formation.">A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation.</a> Nat. Cell Biol. 11, 1433-1437 (2009).</li><li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+in+vivo+analyses+of+cell+function+using+fluorescence+imaging+(*).">Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*).</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 327-332 (2011).</li><li>Mizushima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+autophagosome+formation+using+Apg5-deficient+mouse+embryonic+stem+cells.">Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells.</a> The Journal of Cell Biology. 152, 657-668 (2001).</li><li>Itakura, E., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+autophagosome+formation+site+by+a+hierarchical+analysis+of+mammalian+Atg+proteins.">Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins.</a> Autophagy. 6, 764-776 (2010).</li><li>Axe, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosome+formation+from+membrane+compartments+enriched+in+phosphatidylinositol+3-phosphate+and+dynamically+connected+to+the+endoplasmic+reticulum.">Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum.</a> J Cell Biol. 182, 685-701 (2008).</li><li>Walker, S., Chandra, P., Manifava, M., Axe, E., Ktistakis, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+autophagosomes:+localized+synthesis+of+phosphatidylinositol+3-phosphate+holds+the+clue.">Making autophagosomes: localized synthesis of phosphatidylinositol 3-phosphate holds the clue.</a> Autophagy. 4, 1093-1096 (2008).</li></ol>

O método descrito neste protocolo permite a visualização da localização de uma proteína durante a formação autophagosome. Temos tentado vários métodos de visualização dos eventos descritos incluindo ponto-de varredura confocal, disco giratório confocal e microscopia de fluorescência Total Internal Reflection (TIRF). Descobrimos que para fins gerais padrão de campo amplo epi-fluorescência oferece o melhor compromisso entre a sensibilidade ea resolução. Isso garante bom sinal para ruído, photo-bleaching...

Autophagy é um processo altamente dinâmico, o que requer a coordenação de um grande número de proteínas para o resultado final da formação do autophagosome 1-3. Microscopia é provavelmente o método mais vulgarmente aplicados para estudar autofagia 4. A localização da maioria das proteínas autofagia tem sido extensivamente estudada em células fixadas, quer por imuno-coloração das proteínas endógenas e por expressão de proteína exógena fluorescentemente marcados. Além disso, a microscopia eletrônica (ME), isoladamente e em combinação com marcação imuno-ouro, descreveu os detalhes destas estruturas 5,6. Apesar do facto de que estas técnicas têm estabelecido nossa compreensão da formação autophagosome nas três dimensões do espaço, eles falharam em fornecer uma quantidade suficiente de informação sobre a dimensão de 4 th - tempo. Imagem de células vivas supera esta barreira, uma vez que permite acompanhar a formação de uma autophagosome tão perto quanto possível tempo real 7. Esta técnica foi empregada pela primeira vez para estudar autofagia por Yoshimori e seus colegas 8, e tem sido cada vez mais utilizada daqui em diante. Microscopia de lapso de tempo capta a localização do PI em células vivas e ao longo de um período de tempo. Ao comparar essas informações com a autofagia bem caracterizados e / ou organela marcador, a análise de imagens de células vivas pode colocar o POI no maior contexto espacial e temporal da formação autophagosome. Análise de imagem de células vivas baseia-se na captura repetitiva da localização POI ao longo de todos os passos de formação autophagosome, enquanto que imagens de células fixas baseia-se numa única captura. Portanto, imagens de células vivas pode provar a contribuição do POI em etapas específicas de formação autophagosome, enquanto imagens de células fixas só podem assumir o papel de POI, com base em sua localização média em muitos autophagosomes simultaneamente capturados em diferentes fases do seu lifecycle. Apesar de imagens de células vivas é um método de alto poder analítico, ele tem algumas limitações inerentes, que devem ser levados em consideração. Primeiro de tudo, a imagem de células vivas, requer a expressão de uma ou mais proteínas exógenas marcados com fluorescência. Marcas fluorescentes tendem a ser grande em tamanho, e por vezes, podem alterar o comportamento de uma proteína devido a razões estéricas. Esta situação é acentuado para as proteínas da membrana, uma vez que necessitam para funcionar no espaço limitado das duas dimensões de membranas. De nota, autofagossomas são estruturas membranosas e, consequentemente, a sua formação requer um grande número de proteínas associadas à membrana. Um outro conjunto de problemas é conectado com os níveis de expressão da PI. Em princípio, uma proteína exógena deverá ser expressa em níveis comparáveis ​​aos da proteína endógena. Isto assegura que os reguladores importantes da sua localização sub-celular não vai ser saturado, e thanálise e será biologicamente relevante. Além disso, a sobre-expressão de proteínas autofagia deve ser evitada, tal como quando são expressas acima dos níveis endógenos, que tendem a inibir a resposta autofagia 9. Inversamente, uma vez que os níveis de expressão da PI deve ser suficientemente alta para permitir a sua localização na sequência de um bom período de tempo sem foto-branqueamento, um compromisso deve ser alcançado. Atingir os níveis de expressão de ideais de uma proteína exógena em células de mamíferos requer muita sintonia fina, mas é possível através da criação e seleção linhas de células expressando estavelmente diferentes níveis do POI. A resolução espacial que pode ser obtida com microscopia de fluorescência padrão é outro factor limitante. A resolução pode ser limitada por um número de razões, mas no melhor dos casos, a resolução lateral, será de cerca de 250 nm. Isto significa que quaisquer objectos separados por uma distância menor do que esta aparece ligado (ou como uma únicaobjeto) e objetos menores do que 250 nm será representado na imagem maior do que eles realmente são. Portanto, as imagens devem ser sempre interpretadas com isso em mente e técnicas complementares, tais como EM será necessário para resolver pequenos detalhes ultra-estrutural. Finalmente, a imagem de células vivas requer inerentemente exposição de uma célula à luz, possivelmente durante um período de tempo prolongado. Isto pode alterar as respostas fisiológicas de uma célula, um fenômeno conhecido como foto-toxicidade. Nós utilizamos com sucesso imagens de células vivas da proteína de ligação PI3P DFCP1 descrever, pela primeira vez, que se originam a partir autofagossomas PI3P ricos em anel, como estruturas denominadas omegasomes, que estão em estreita associação com ER fios 10,11. Mostrámos claramente que as estruturas LC3-positivos começam a se formar em estreita associação com omegasomes. Nós, aqui sugerem que emprega uma linha de células que expressam estavelmente GFP DFCP1 para a célula vivaimagiologia da proteína de interesse, estabelece uma estrutura espacial e temporal robusta para a caracterização do seu papel na formação autophagosome.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>OptiMEM I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-062</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MitoTracker Red FM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M22425</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LysoTracker Red DND-99</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L-7528</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>22 mm coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0159</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm plates</td>
			<td>Fisher NUNC</td>
			<td>153066</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Silicon grease</td>
			<td>RS Components Ltd. </td>
			<td>RS 494-124</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>O-rings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-7816</td>
			<td>Suggested alternative to custom-made O-rings</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO 100XO</td>
			<td>N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA-R2 C10600 10B</td>
			<td>Progressive scan interline CCD</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Illuminator</td>
			<td>TILL Photonics</td>
			<td>Polychrome V</td>
			<td>Ultrafast monochromator</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Incubation chamber</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td>Cell^R IX81</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SIS xcellence</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

live cell imaging of early autophagy events: omegasomes and beyond

Autophagy é uma resposta celular desencadeada pela falta de nutrientes, em particular a ausência de aminoácidos. Autophagy é definido pela formação das estruturas de membrana dupla, chamada autofagossomas, que sequestram o citoplasma, proteínas de longa duração e os agregados de proteína, organelas defeituosos, e até mesmo vírus ou bactérias. Autophagosomes eventualmente fundir-se com os lisossomas levam a uma degradação do seu conteúdo em massa, produzidos com os nutrientes a ser reciclado de volta para o citoplasma. Portanto, autofagia é crucial para a homeostasia celular, e a desregulação de autofagia pode levar a doença, mais notavelmente a neurodegeneração, envelhecimento e cancro. Formação autophagosome é um processo muito elaborado, pelo qual as células foram definidos para um grupo específico de proteínas, chamado de máquinas autofagia núcleo. A maquinaria autofagia núcleo é funcionalmente complementadas por proteínas adicionais envolvidas em diversos processos celulares, por exemplo, em membrantráfico de e, em biologia mitocondrial e lisossomal. Coordenação destas proteínas para a formação e degradação de autofagossomas constitui a resposta dinâmica e altamente sofisticadas de autofagia. Imagem de células vivas permite seguir a contribuição molecular de cada proteína relacionada autofagia até ao nível de um único evento de formação autophagosome e em tempo real, pelo que esta técnica oferece uma resolução temporal e espacial elevada. Aqui usamos uma linha celular estável expressando GFP-DFCP1, para estabelecer um contexto temporal e espacial para a nossa análise. DFCP1 omegasomes marcas, que são estruturas precursoras que conduzem à formação autofagossomas. Uma proteína de interesse (POI) pode ser marcado com um vermelho ou ciano etiqueta fluorescente. Diferentes organelas, como o ER, mitocôndrias e lisossomos, estão todos envolvidos em diferentes etapas de formação autophagosome, e podem ser marcadas com um corante rastreador específico. Microscopia de lapso de tempo de AUTOPHagy nesta montagem experimental, permite que a informação a ser extraído sobre a quarta dimensão, ou seja, o tempo. Assim podemos seguir a contribuição do POI para autofagia no espaço e no tempo.

No protocolo descrito, utilizou-se microscopia de lapso de tempo a seguir a localização de PCP marcado com LC3 numa linha de células que expressam estavelmente GFP DFCP1, sob condições indutoras autofagia. O resultado desta experiência é a captura de duas séries ou pilhas de imagens, uma do verde e uma do canal azul, correspondentes a GFP-DFCP1 e CFP-LC3. Analisamos ainda mais esses vídeos usando ImageJ, a fim de criar montagens correspondentes a eventos únicos formação autophagosome, conforme descrito na se...

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Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Microscopia de lapso de tempo de marcadores autofagia fluorescente etiquetado permite o monitoramento da resposta autofagia dinâmico com alta resolução temporal. Usando autofagia organela específica e marcadores numa combinação de três cores diferentes, pode-se seguir a contribuição de uma proteína para a formação autophagosome num contexto espacial e temporal robusta.

Imagens de células vivas dos primeiros autofagia Eventos: Omegasomes and Beyond

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