Name: live cell imaging of early autophagy events: omegasomes and beyond
Uploaded: 2013-07-27T14:00:00
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Nuestro trabajo es apoyado por la Biotecnología y Ciencias Biológicas de Investigación. Nos gustaría agradecer a Prof Tamotsu Yoshimori para nosotros proporcionar amablemente con el plásmido para la expresión de PPC-LC3.

1. Preparación de células <ol><li> Semilla bajo número de pases de las células HEK-293T que expresan establemente GFP-DFCP1 en cubreobjetos redondos 22 mm; células de cultivos de una noche en medio Dulbecco Modificado de Eagles (DMEM), a una confluencia de 30-40% (objetivo para una confluencia de 80% después de 2 día - día de imágenes de células vivas). </li></ol> 2. Transfección celular <ol><li> Preparar la mezcla de complejo de transfección para cada plato, que contiene 100 l Op...

<ol>
	<li>Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+process+and+function.">Autophagy: process and function.</a> Genes Dev. 21, 2861-2873 (2007).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Atg+proteins+in+autophagosome+formation.">The role of Atg proteins in autophagosome formation.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27, 107-132 (2011).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+from+phenomenology+to+molecular+understanding+in+less+than+a+decade.">Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 931-937 (2007).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+revisited:+a+conversation+with+Christian+de+Duve.">Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve.</a> Autophagy. 4, 740-743 (2008).</li><li>Yla-Anttilba, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tomography+reveals+connections+between+the+phagophore+and+endoplasmic+reticulum.">3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum.</a> Autophagy. 5, 1180-1185 (2009).</li><li>Hayashi-Nishino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subdomain+of+the+endoplasmic+reticulum+forms+a+cradle+for+autophagosome+formation.">A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation.</a> Nat. Cell Biol. 11, 1433-1437 (2009).</li><li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+in+vivo+analyses+of+cell+function+using+fluorescence+imaging+(*).">Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*).</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 327-332 (2011).</li><li>Mizushima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+autophagosome+formation+using+Apg5-deficient+mouse+embryonic+stem+cells.">Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells.</a> The Journal of Cell Biology. 152, 657-668 (2001).</li><li>Itakura, E., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+autophagosome+formation+site+by+a+hierarchical+analysis+of+mammalian+Atg+proteins.">Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins.</a> Autophagy. 6, 764-776 (2010).</li><li>Axe, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosome+formation+from+membrane+compartments+enriched+in+phosphatidylinositol+3-phosphate+and+dynamically+connected+to+the+endoplasmic+reticulum.">Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum.</a> J Cell Biol. 182, 685-701 (2008).</li><li>Walker, S., Chandra, P., Manifava, M., Axe, E., Ktistakis, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+autophagosomes:+localized+synthesis+of+phosphatidylinositol+3-phosphate+holds+the+clue.">Making autophagosomes: localized synthesis of phosphatidylinositol 3-phosphate holds the clue.</a> Autophagy. 4, 1093-1096 (2008).</li></ol>

El método descrito en este protocolo permite la visualización de la localización de una proteína durante la formación de autofagosoma. Hemos intentado varios métodos de visualización de los eventos descritos como punto confocal de barrido, disco giratorio confocal y de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) microscopía. Hemos encontrado que para los propósitos generales de campo amplio epi-fluorescencia estándar proporciona el mejor compromiso entre la sensibilidad y la resolución. Esto asegura una ...

La autofagia es un proceso muy dinámico, que requiere la coordinación de un gran número de proteínas para el resultado final de la formación autophagosome 1-3. Microscopía es probablemente la técnica más comúnmente aplicada para el estudio de la autofagia 4. La localización de la mayoría de las proteínas de la autofagia ha sido ampliamente estudiado en células fijadas, tanto por inmuno-tinción de las proteínas endógenas y por la expresión de la proteína exógena marcado con fluorescencia. Además, la microscopía electrónica (EM), solo y en combinación con el etiquetado inmuno-oro, ha descrito los detalles finos de estas estructuras 5,6. A pesar del hecho de que estas técnicas han establecido nuestra comprensión de la formación autofagosoma en las 3 dimensiones del espacio, que no han logrado proporcionar suficiente cantidad de información acerca de la 4 ª dimensión - tiempo. Imágenes de células en vivo supera esta barrera ya que permite después de la formación de un autofagosoma tan cerca como seable a tiempo real 7. Esta técnica se utilizó primero para estudiar la autofagia por Yoshimori y colegas 8, y se ha utilizado cada vez más en adelante. Microscopía de lapso de tiempo captura la localización del punto de interés en células vivas y durante un período de tiempo. Al comparar esta información con la autofagia bien caracterizado y / u orgánulo marcador, el análisis de imágenes de células vivas puede poner el punto de interés en el mayor contexto espacial y temporal de la formación autophagosome. Análisis de imágenes de células vivas se basa en la captura repetitiva de la localización a lo largo de PDI todos los pasos de la formación de autofagosoma, mientras que las imágenes de células fijadas se basa en una sola captura. Por lo tanto, imágenes de células vivas puede demostrar la contribución de los POI a los pasos específicos de formación autophagosome, mientras que las imágenes de las células fijas sólo puede asumir la función de punto de interés, en base a su localización media en muchos autofagosomas capturados simultáneamente en diferentes etapas de su lifecycle. A pesar de imágenes de células vivas es un método de alta capacidad analítica, tiene algunas limitaciones inherentes que deben ser tomados en consideración. En primer lugar, imágenes de células vivas requiere la expresión de una o más proteínas exógenos marcados con fluorescencia. Etiquetas fluorescentes tienden a ser grandes en tamaño y que a veces puede alterar el comportamiento de una proteína debido a razones estéricas. Esta situación se ve acentuada por las proteínas de membrana, ya que necesitan para funcionar en el espacio limitado de las 2 dimensiones de las membranas. De nota, autofagosomas son estructuras membranosas, y en consecuencia su formación requiere un gran número de proteínas asociadas a la membrana. Otro conjunto de problemas está conectado a los niveles de expresión de la PDI. En principio, una proteína exógena debe ser expresada a niveles comparables a la proteína endógena. Esto asegura que los reguladores importantes de su localización sub-celular no estarán saturados, y thanálisis e será biológicamente relevante. Por otra parte, la sobreexpresión de proteínas de la autofagia se debe evitar, como cuando se expresan por encima de los niveles endógenos, que tienden a inhibir la respuesta autofagia 9. A la inversa, ya que los niveles de expresión del POI debe ser lo suficientemente alta como para permitir seguir su localización por un buen período de tiempo sin foto-blanqueo, un compromiso se ha alcanzado. El logro de los niveles de expresión óptimos de una proteína exógena en células mamíferos requiere mucha sintonía fina, pero es factible mediante el establecimiento y la detección de líneas celulares que expresan de forma estable los diferentes niveles de la PDI. La resolución espacial que se puede lograr con microscopía de fluorescencia estándar es otro factor limitante. La resolución puede ser limitado por una serie de razones, pero en el mejor, resolución lateral será de alrededor de 250 nm. Esto significa que los objetos separados por una distancia menor que esta aparecerán conectado (o como una solaobjeto) y objetos de menos de 250 nm estarán representados en la imagen más grande de lo que realmente son. Por lo tanto, las imágenes siempre deben interpretarse teniendo esto en cuenta y las técnicas complementarias como la EM tendrán que resolver detalles finos ultra-estructural. Por último, imágenes de células vivas requiere inherentemente exposición de una célula a la luz, potencialmente, para un período de tiempo prolongado. Esto puede alterar las respuestas fisiológicas de una célula, un fenómeno conocido como foto-toxicidad. Hemos utilizado con éxito imágenes de células vivas de la proteína de unión a PI3P DFCP1 para describir por primera vez que se originan a partir de autofagosomas PI3P ricas en estructuras en forma de anillo omegasomes denominados, que están en estrecha asociación con ER hebras 10,11. Hemos demostrado claramente que las estructuras de LC3-positivos se empiezan a formar en estrecha asociación con omegasomes. Estamos aquí, sugerimos que el empleo de una línea celular estable expresando GFP-DFCP1 para la célula vivaimagen de la proteína de interés, establece un marco espacial y temporal robusto para la caracterización de su papel en la formación autophagosome.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>OptiMEM I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-062</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MitoTracker Red FM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M22425</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LysoTracker Red DND-99</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L-7528</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>22 mm coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0159</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm plates</td>
			<td>Fisher NUNC</td>
			<td>153066</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Silicon grease</td>
			<td>RS Components Ltd. </td>
			<td>RS 494-124</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>O-rings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-7816</td>
			<td>Suggested alternative to custom-made O-rings</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO 100XO</td>
			<td>N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA-R2 C10600 10B</td>
			<td>Progressive scan interline CCD</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Illuminator</td>
			<td>TILL Photonics</td>
			<td>Polychrome V</td>
			<td>Ultrafast monochromator</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Incubation chamber</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td>Cell^R IX81</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SIS xcellence</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

live cell imaging of early autophagy events: omegasomes and beyond

La autofagia es una respuesta celular provocada por la falta de nutrientes, especialmente la ausencia de aminoácidos. La autofagia se define por la formación de estructuras de doble membrana, llamada autofagosomas, que secuestran citoplasma, proteínas de larga duración y los agregados de proteínas, orgánulos defectuosos, e incluso virus o bacterias. Autofagosomas finalmente se fusionan con los lisosomas que conducen a la degradación mayor parte de su contenido, con los nutrientes producidos se reciclan de nuevo al citoplasma. Por lo tanto, la autofagia es fundamental para la homeostasis celular y la desregulación de la autofagia puede conducir a la enfermedad, sobre todo la neurodegeneración, el envejecimiento y el cáncer. Formación autophagosome es un proceso muy elaborado, para el cual las células han asignado un grupo específico de proteínas, llamada la maquinaria autofagia núcleo. La maquinaria de la autofagia núcleo está funcionalmente complementa con proteínas adicionales que intervienen en diversos procesos celulares, por ejemplo, en membranel tráfico de correo, en la biología mitocondrial y lisosomal. La coordinación de estas proteínas para la formación y la degradación de autofagosomas constituye la respuesta altamente dinámica y sofisticada de la autofagia. Imágenes de células vivas permite seguir la contribución molecular de cada proteína relacionada con la autofagia hasta el nivel de un solo evento de formación autofagosoma y en tiempo real, por lo tanto, esta técnica ofrece una alta resolución temporal y espacial. Aquí se utiliza una línea celular estable expresando GFP-DFCP1, para establecer un contexto espacial y temporal para nuestro análisis. DFCP1 marcas omegasomes, que son estructuras precursoras conducen a la formación autofagosomas. Una proteína de interés (POI) puede ser marcado con una etiqueta de color rojo o cian fluorescente. Los diferentes orgánulos, como el ER, las mitocondrias y los lisosomas, están todos involucrados en diferentes etapas de formación de autofagosoma, y ​​pueden ser marcados utilizando un rastreador tinte específico. Time-lapse microscopía de autophagy en este montaje experimental, permite que la información se extrae de la cuarta dimensión, es decir, tiempo. Por lo tanto podemos seguir la contribución del POI de la autofagia en el espacio y el tiempo.

En el protocolo descrito, hemos utilizado la microscopía de lapso de tiempo para seguir la localización de la PPC de etiquetado LC3 en una línea celular estable expresando GFP-etiquetados DFCP1, en condiciones que inducen la autofagia. El resultado de este experimento es la captura de 2 series o pilas de imágenes, uno de la verde y uno desde el canal azul, correspondientes a GFP-DFCP1 y CFP-LC3. Hemos analizado más estos videos usando ImageJ, con el fin de crear montajes correspondientes a eventos de formación aut...

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Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Time-lapse microscopía de marcadores autofagia marcados con fluorescencia permite la monitorización de la respuesta de la autofagia dinámico con alta resolución temporal. Usando la autofagia específico y los marcadores de orgánulos en una combinación de 3 colores diferentes, podemos seguir la aportación de una proteína a la formación autophagosome en un contexto espacial y temporal robusto.

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